[发明专利]分裂循环和TAPE扩增

说明书

本文描述了用于定量检测核酸样品中的序列的方法和组合物。该方法通常涉及将核酸样品分配到离散反应室中的大量混合物分区中。另一方面，在标记扩增子引物延伸(TAPE)反应中分析分配的样品。在TAPE反应中，使用一对5＇‑加尾扩增引物，一个5＇‑加尾正向引物和一个5＇‑加尾反向引物扩增靶序列。在另一方面，本发明提供了对核酸样品中的野生型和突变型靶核酸片段的频率进行定量的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年12月30日提交的美国临时专利申请号62/273,210的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

定量检测核酸样品中的靶序列(例如，等位基因，多态性等)可用于多种背景。例如，稀有靶序列的检测可用于早期，良性或恶性肿瘤检测或监测；产前诊断，如无创胎儿诊断；检测病毒或细菌感染；环境监测等。在某些情况下，为了在高度丰富的非靶序列的背景下检测低丰度的靶序列，这种检测需要高灵敏度，准确度和精确度水平。

发明内容

本文描述了用于定量检测核酸样品中的序列的方法和组合物。该方法通常涉及将核酸样品划分到离散反应室(例如孔，通道，液滴等)中的大量混合物分区(partition)中。在一个方面，在分裂循环测定中分析划分(partitioned)的样品，其中在一组初始核酸扩增循环中使用具有相对低的退火温度的一对等位基因特异性扩增引物将高温引物结合位点附加到靶序列中。一组初始核酸扩增循环包括低温退火步骤。在随后的核酸扩增循环中，与高温引物结合位点杂交的一对侧翼扩增引物提供高保真度和高度特异性扩增。一组后续核酸扩增循环包括较高温度退火步骤。

在另一个方面，在分裂循环测定中分析划分的样品，其中在一组初始核酸扩增循环中使用具有相对高的退火温度的一对等位基因特异性扩增引物将低温引物结合位点附加到靶序列中。一组初始核酸扩增循环包括相对高温退火步骤。在随后的核酸扩增循环中，与低温引物结合位点杂交的一对侧翼扩增引物提供高保真度和高度特异性扩增。一组后续核酸扩增循环包括相对较低温度退火步骤。

另一方面，在标记扩增子引物延伸(TAPE)反应中分析划分的样品。在TAPE反应中，使用一对5＇末端扩增引物，一个5＇-加尾正向引物和一个5＇-加尾反向引物扩增靶序列。5＇-加尾正向和反向引物的尾互为反向互补物。因此扩增反应产生掺入标签的扩增子(即，标记的扩增子)。得到的标记的扩增子具有互为反向互补物的3＇末端，因此可用作引物。因此，反应自我产生引物，防止扩增反应期间引物耗尽。在一些实施方式中，TAPE引物可以用于进一步包括被配置为与扩增子标签杂交的侧翼引物的分裂循环测定中。

另一方面，本发明提供多个混合物分区，这些单独的混合物分区包含：i)突变特异性5＇-加尾引物对，其中突变特异性5＇-加尾引物对与靶DNA模板分子杂交并特异性扩增靶DNA模板分子，该靶DNA模板分子来自包含突变靶序列的核酸样品，如果存在，其中突变特异性5＇-加尾引物对的引物包含：a)长度为至少10个核苷酸且小于30个核苷酸的3＇杂交区域，其与突变靶序列特异性杂交；和b)长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的突变特异性5＇尾区，其不与核酸样品中的任何核酸片段杂交；ii)野生型特异性5＇-加尾引物对，其中野生型特异性5＇-加尾引物对杂交并特异性扩增包含野生型靶序列(如果存在)的靶DNA模板分子，其中野生型特异性5＇-加尾引物对的引物包含：a)与野生型靶序列特异性杂交的长度为至少10个核苷酸且小于30个核苷酸的3＇杂交区域；和b)长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的野生型特异性5＇尾区，其不与核酸样品中的任何核酸片段杂交，其中野生型特异性5＇尾区是与突变特异性5＇尾区不同的序列；和iii)突变特异性侧翼引物对，其中所述突变特异性侧翼引物对杂交并特异性扩增包含突变特异性5＇-加尾引物对的5＇尾区的扩增子(如果存在)；iv)野生型特异性侧翼引物对，其中野生型特异性侧翼引物对杂交并特异性扩增包含野生型特异性5′-加尾引物对的5′尾区的扩增子(如果存在)；和v)热稳定聚合酶，其中所述多个混合物分区的至少约1-10个混合物分区含有包含野生型或突变型靶序列的靶DNA模板分子；并且所述多个混合物分区的至少约3-10个混合物分区不包含靶DNA模板分子。