[发明专利]增补精氨酸以改善气体发酵产乙酸菌的效率

说明书

本发明提供了通过增补精氨酸来改善发酵效率的方法和其所用的基因修饰细菌。更具体地说，本发明提供(i)通过增补精氨酸来增加ATP密集型产物的产量；(ii)通过C1固定细菌来增加精氨酸的利用；和(iii)向C1固定细菌提供优化的精氨酸脱胺酶路径的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年12月3日提交的美国临时专利申请第62/262,886号和2015年12月3日提交的美国临时专利申请第62/262,888号的权益，所述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

目前全世界有大约10％的能量需求及商用化学品是由可再生原料生产，主要使用种植糖生产。然而，为了满足气候目标，非食物资源的未来使用受到越来越多的关注。气体发酵提供了一条将广泛范围的易得低成本C1原料(例如工业废气、合成气或重整甲烷)利用于化学品及燃料的途径。伍德永达尔路径(Wood Ljungdahl pathway)据信为问世的第一生物化学路径之一，其使得产乙酸梭菌(acetogenic Clostridia)能够将这些C1气体固定在乙酰基-CoA中。自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)尤其为气体发酵提供稳固及灵活都平台且已在工业规模上得到采用。气体自产乙醇梭菌发酵具有高度选择性，耐受污染物，解决了费歇尔-托普希方法(Fischer-Tropsch process)的折射问题且即使以小体积气体流供应，仍为经济可行的。

已知尽管产乙酸菌能够制造许多有用的短链化学品，但归因于ATP限制性，生产适用于生物柴油或喷气燃料的较长链碳分子超出产乙酸细菌自身代谢能力之外。Fast等人确定，尽管伍德永达尔路径是制造乙酸酯及乙醇的最佳实施路径，但丁醇发酵是ATP限制性过程，致使通过伍德永达尔路径进行的丁醇厌氧制造效率低下。

自产乙醇梭菌天然地产生乙酸酯、乙醇、2,3-丁二醇(2,3-BDO)及乳酸酯。如果能克服能量阻碍，则合成生物学有望增大产乙醇梭菌的产物范围。产乙酸细菌在自然界中分布广泛且在全球碳循环中起主要作用，但被认为是生存于热力学生命边缘。

厌氧产乙酸菌的伍德-永达尔路径的能量学刚刚兴起，但不同于在好氧生长条件下或糖发酵生物糖解，伍德-永达尔路径不能通过底物水平的磷酸化而获得ATP，实际上，活化CO₂成为甲酸酯实际上需要一个ATP分子且需要膜梯度。[WO2013/180584]。

通过底物水平磷酸化产生ATP可以用作产物合成的驱动力，尤其在ATP限制性系统中。具体地说，已知产乙酸细菌生存于热力学生命边缘(Schuchmann,《自然评论：微生物(Nat Rev Microbiol)》,12:809-821,2014)。因此，迄今分离出的可产生乙酸酯的产乙酸微生物已有描述(Drake,产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes),《原核生物(TheProkaryotes)》,第3版,第354-420页,New York,NY,Springer,2006；Liew等人，通过靶向突变诱发洞察自产乙醇梭菌的CO2固定路径(Insights into CO2Fixation Pathway ofClostridium autoethanogenum by Targeted Mutagenesis)》.mBio2016,7:e00427-16)，因为乙酸酯的产生向微生物提供直接产生ATP的选项，这是磷酸化转乙酰酶(Pta)(EC2.3.1.8)和乙酸激酶(Ack)(EC 2.7.2.1)通过底物水平磷酸化来实现。Pta-Ack系统对乙酰基-CoA转化为乙酸酯具有高度特异性且不利用其它酰基-CoA。尽管例如膜梯度及与离子或质子易位系统(例如Rnf复合物)(Schuchmann,《自然评论：微生物》,12:809-821,2014)偶合的电子分叉酶的机制使这些微生物中的ATP得以保存，但直接的ATP产生对其存活仍为至关重要的。因此，在引入不允许ATP产生之异源路径时，乙酸酯作为副产物产生(Schiel-Bengelsdorf,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett)》,586:2191-2198,2012)。