[发明专利]从宏基因组学衍生的纤维素酶

说明书

本发明涉及来自土壤宏基因组的新型内切葡聚糖酶基因(GH5家族)。更具体而言，本发明提供了重组质粒和用于表达具有纤维素酶活性的新型基因序列的重组宿主。本发明的纤维素酶对底物如羧甲基纤维素和大麦‑β‑葡聚糖等中的β‑1,4键具有高比活性。这种新型纤维素酶可具有许多工业应用，例如，食品和饲料工业、洗涤剂、纺织和生物燃料工业等。

技术领域

本发明提供了来自土壤宏基因组的新型内切葡聚糖酶基因(GH5家族)。更具体而言，本发明提供了重组质粒和用于表达具有纤维素酶活性的新型基因序列的重组宿主。本发明的纤维素酶对底物如羧甲基纤维素和大麦-β-葡聚糖等中的β-1,4键具有高比活性。这种新型纤维素酶可具有许多工业应用，例如，食品和饲料工业、洗涤剂、纺织和生物燃料工业等。

背景技术

一方面需求的不断增加和另一方面化石燃料作为能源的日益枯竭已使得开发替代能源成为必要。使用天然丰富的木质纤维素生物质如农业废弃物、林业废弃物和城市废弃物生产可再生生物燃料将减小社会对化石燃料的依赖。纤维素是木质纤维素的主要组分，已经在很大程度上认识到对新型且高效的纤维素酶的需要(Xing等,2012)。

纤维素酶可用于各种各样的工业应用中，如用于造纸工业中以使再生纸脱墨，用于纺织工业以使织物生物抛光和降低棉布的粗糙度，用于洗衣业作为洗涤剂的添加剂，用于食品和饲料工业以改善食物的可消化性，用于酿造工业和农业以实现作物的生物加工，及用于许多其他应用(Bhat,2000；Xing等,2012)。

纤维素酶属于酶的糖基水解酶家族，其以协同方式催化纤维素水解。内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)随机切割内部1,4-β-D-葡聚糖键，产生游离的末端。外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91和3.2.1.176)逐步作用于还原性和非还原性末端以释放纤维二糖。所产生的二糖然后由β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)消化以释放游离的葡萄糖。这些酶协同作用而导致纤维素水解(Aubert等,1988；Lynd等,2002)。

内切葡聚糖酶是引发和导致内部键的广泛水解的主要的酶。根据碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org/)(Lombard等,2014)的分类，内切葡聚糖酶属于糖基水解酶家族的14个家族。

发现新型纤维素酶的方法之一是通过宏基因组学，宏基因组学是研究微生物多样性和探索具有工业重要性的新型酶的独立于培养的方法(Handelsman,2004；Zengler等,2002)。

在各种自然环境中，土壤就其中存在的微生物区系而言是最具多样性和挑战性的(Daniel,2005)。已从土壤宏基因组学发现了许多新型的工业相关酶，如纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶等(Daniel,2005；Xing等,2012)。这些酶中的若干在活性、特异性、稳定性等方面具有远优于已知酶的性质。

许多纤维素酶已从宏基因组研究中获得，其具有显著的性质，如热稳定性、盐稳定性、pH稳定性。作为实例，已从奶牛的瘤胃液分离出新型宏基因组GH5纤维素酶，其对广泛的底物具有活性(Ko等,2013)。已从甘蔗渣分离出在75℃下具有最佳活性的嗜热GH9内切葡聚糖酶(Kanokratana等,2014)。从叶枝堆肥分离出的宏基因组衍生GH12纤维素酶具有90℃的最适温度(Okano等,2014)。从牛的瘤胃分离出的纤维素酶对作为底物的CMC具有在6-70U/mg范围内的比活性(Ferrer等,2008)。与具有工业相关性的更新型的蛋白质相关的这样的性质对于收获生物质作为可负担且绿色的能源这一充分和成功的目标来说是极其需要的。

因此，本发明的目的在于提供纤维素酶，其在高温下在宽pH范围内具有活性，对一系列化学和物理条件具有广泛的稳定性和耐受性，在盐和化学品等的存在下具有高活性。

附图说明

图1：来自质粒文库的阳性克隆的测序揭示了由多个开放阅读框组成的5553个碱基的基因簇。