[发明专利]同量异位质量标记

说明书

本发明涉及两个或更多个质量标记的组，其中每个质量标记包括下式：X‑L‑M‑Re，其中X是具有确切质量的报道部分，L是质谱仪中通过碰撞可裂解的键，M是质量改性剂，并且Re是a)用于将所述质量标记附接至分析物的反应性官能团或者b)所述分析物，其中所述组中的每个质量标记具有整数质量，其中所述组中的每个质量标记具有相同的整数质量，并且其中所述组包括质量标记的两个或更多个亚组，每个亚组包括一个、两个或更多个质量标记，并且其中当所述亚组包括两个或更多个质量标记时，所述亚组中的每个质量标记的报道部分X的确切质量与同一亚组和所有其他亚组中的质量标记的报道部分X的确切质量不同，并且其中每个质量标记能够通过质谱来区分。

发明领域

本发明涉及用于标记肽的有用的反应性标记并且涉及使用这些反应性标记的方法，以鉴定和定量肽，特别是来源于复杂蛋白质混合物的肽。这些反应性标记对于通过高分辨率和高质量精度的质量分析仪如轨道离子阱(orbitrap)、飞行时间和离子回旋共振质量分析仪来分析肽特别有价值。

发明背景

生物系统的研究，特别是对人类疾病的理解，取决于检测由疾病引起或应答于疾病的生物系统变化的能力。这些变化提供了诊断手段，并为治疗性化合物如疫苗和药物的靶标提供了见解。需要定量测量多种生物分子以了解疾病过程，包括核酸、蛋白质、甾体、糖和脂质。在这种情况下，使用质谱仪定量检测这些生物分子的能力已经在其研究和应用于人类以及兽医疾病方面提供了相当大的进步。环境分析和监测以及食品和饮料制造业也取得了同样的进展。特别是使用稳定同位素来提供合成的定量参考已经在同位素稀释质谱中用于监测所有类别的生物分子。然而，这些方法传统上需要可用的合成标准，但这并不总是可行的。

最近，一系列带有重同位素替换的化学质量标签已经被开发出来，以进一步改进通过质谱对生物分子的定量分析。取决于标签设计，标签组的成员是具有相同化学结构但不同绝对质量，或同量异位和同位异构的同位素，具有相同的结构和绝对质量。同位素标签通常用于MS模式下的定量分析，而同量异位标签必须在MS/MS模式下进行破碎以释放独特质量的报告碎片。

同位素质量标签的早期例子是同位素编码亲和标签(ICAT)(Gygi,S.P.等,(1999)Nat Biotechnol,17,994-999)。ICAT试剂是一对质量标签，在一个(重)标签中带有重同位素的差异掺入，而在另一个(轻)标签中没有取代。两个样品用重或轻标签标记，然后混合，然后通过LC-MS分析。两种样品中存在的肽将产生质量与重同位素原子取代数量成比例不同的一对前体离子。

ICAT方法还说明了“抽样”方法，这种方法可以协调处理少量多肽的需要，以减少生成的质谱的复杂性，同时保留关于原始样品的足够信息以确定其组分。在ICAT方法中使用的“同位素编码的亲和标签”包括一对生物素接头同位素，其对巯基具有反应性，用于捕获包括半胱氨酸的肽。典型地，蛋白质组中90-95％的蛋白质将具有至少一个含半胱氨酸的肽，并且通常含半胱氨酸的肽代表总共约1/10的肽，因此含半胱氨酸肽的分析大大降低了样品的复杂性，而不会丢失关于样品的重要信息。因此，在ICAT方法中，来自一个来源的蛋白质样品与“轻”同位素生物素接头反应，而来自第二来源的蛋白质样品与“重”同位素生物素接头反应，其通常为比轻同位素重4至8道尔顿。然后合并两个样品并用内肽酶进行裂解。然后可以将生物素化的含半胱氨酸的肽在经抗生物素蛋白化的珠子上进行分离，用于随后的质谱分析。两个样品可以进行定量比较：相应的肽对作为相互的标准，可以对其比值进行定量。ICAT抽样方法产生的肽混合物仍然准确代表了来源样品，虽然不如MudPIT复杂，但仍然分离出大量的肽，并且它们通过LC-MS/MS分析产生复杂的谱。用2个ICAT标签，与无标记分析相比，质谱中的肽离子数增加了一倍。

同位素标记的其他实例包括提供多达四种不同试剂的ICPL试剂，并且采用ICPL，质谱中肽离子的数量是无标记分析的四倍。出于这个原因，用简单的重同位素标签设计开发非常高水平的多重检测是不可行的。