[发明专利]用于减少接头-二聚体形成的方法和试剂盒

说明书

本教导涉及用于减少接头‑二聚体形成的方法，特别是当制备用于随后扩增和/或测序的目的核酸时。还描述了用于实施某些公开的方法的试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年11月17日提交的，题为“用于减少接头-二聚体形成的方法和试剂盒”的美国临时申请序列号62/256,662的权益，该临时申请以引用的形式全文纳入本文中。

关于联邦资助研究的声明

本研究部分在NSF II期资助号1431020的政府支持下进行。政府可对要求保护的发明享有一定权利。

技术领域

本教导通常涉及核酸测序领域，特别涉及减少接头二聚体形成。更特别地，本教导涉及改进包含小RNA分子的测序文库的产生。

背景技术

使用下一代测序技术的小RNA测序(sRNA-seq)对于诸如癌症、干细胞生物学和表观遗传基因调控的领域中的小RNA序型分析和发现而言是非常宝贵的。sRNA-seq文库制备在历史上具有三个主要的缺陷：严重偏差，需要基于凝胶的纯化，以及缺少低输入方案。减少接头-二聚体产物的形成是成功产生这些文库的关键方面。

需要通过凝胶(通常通过PAGE凝胶)来纯化最终的小RNA测序文库，这是由于文库制备的PCR步骤之后接头-二聚体分子与包含插入片段的分子在尺寸上的小差异。在典型的DNA或RNA文库制备中，包含插入片段的分子比接头-二聚体分子至少长100bp，因此可使用固相可逆性固定化(SPRI)磁珠将包含插入片段的分子除去。然而，由于在小RNA文库中包含插入片段的分子仅比接头-二聚体分子长约20bp，SPRI尺寸选择不可行，必须进行基于凝胶的选择。对基于凝胶的尺寸选择的需求严重限制了小RNA文库制备的通量和自动化潜力，因为只有有限数目的文库可在单一凝胶上进行电泳，并且这是不适于自动化的劳动密集型过程。

缺少sRNA-seq的低输入方案也与接头-二聚体形成有关。小RNA测序在某种程度上的独特之处在于，额外的PCR循环导致可忽略的偏差；因此理论上它应该可以通过使用多个PCR循环来产生低输入小RNA文库。然而，文库中存在的接头-二聚体也会被大量扩增，这最终产生其中接头-二聚体产物极其丰富的文库，使得难以分离包含插入片段的产物，并且获得其中仅有非常少的读段是有用的测序数据。已开发了许多方法来减少小RNA文库制备中接头-二聚体的形成，但遗憾的是，这些方法都无法有效地将接头-二聚体形成减少到这样的程度，即使得无凝胶或低输入小RNA文库的制备成为可能。

目前有多种方法用于减少接头-二聚体产物。在这些方法之一中，在第一连接步骤之后互补寡核苷酸退火至3’接头，这将过量的3’接头从单链DNA转化为双链DNA。双链DNA对于随后反应中使用的T4RNA连接酶1酶而言是较差的底物，使得接头-二聚体产物的形成减少。

sRNA文库构建的传统方法已证明具有严重的偏差，导致最终的测序结果不能准确地代表起始材料中小RNA的相对丰度。该偏差可通过使用在连接接合处具有随机化碱基的寡核苷酸接头而大大减小。然而，当使用具有随机化末端的接头时，互补寡核苷酸杂交策略无法良好发挥作用以减少接头-二聚体形成。因此，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行的中间连接产物的纯化通常用于sRNA文库制备方案，该方案利用具有随机化末端的接头。通过PAGE进行的产物纯化具有许多缺点，因此开发了无凝胶、接头-二聚体减少策略。该策略需要使用与异丙醇和SPRI珠结合的专用试剂，以在第一连接步骤之后耗尽过量的3’接头，从而减少最终文库中接头-二聚体的形成。然而，应当注意的是，该策略和使用常规(含有非随机化末端的)接头的策略通常都未能有效地减少接头-二聚体形成到这样的水平，即通过PAGE进行的最终纯化可被基于SPRI的方法替代。

因此，在某些分子生物学技术中需要用于减少接头-二聚体产物形成的方法，包括产生核酸测序文库。例如但不限于，用于RNA(包括小RNA)的下一代测序的RNA文库。

发明内容