[发明专利]在细胞培养物中产生病毒

说明书

本发明涉及体外复制病毒的方法。具体地，本发明涉及经遗传学修饰的细胞群和/或用外源性化合物处理的细胞群，其中与缺乏遗传学修饰和/或缺乏外源性化合物处理的细胞相比所述细胞能够产生更多的病毒。本发明还涉及产生这种细胞群的方法以及使用所获得的病毒来制备疫苗组合物的用途。

技术领域

本发明涉及体外复制病毒的方法。具体地，本发明涉及经遗传学修饰的细胞群和/或用外源性化合物处理的细胞群，其中细胞能够比缺乏遗传学修饰和/或缺乏外源性化合物处理的细胞产生更多的病毒。本发明还涉及产生这类细胞群的方法以及使用所获得的病毒来制备疫苗组合物的用途。

背景技术

病毒感染仍然是在人类和在对经济重要的牲畜中都存在的一个重要的健康问题，产生不良的经济和社会后果。

预防动物病毒性疾病的主要方法之一是疫苗接种。足够量的病毒的可用性以及与病毒产生相关联的成本是疫苗生产的限制性因素。由于依赖丰富的蛋供应，生产流感疫苗和其他疫苗目前存在局限性。当面对生产足够的疫苗来对付新出现的流行性疾病或用于预防流行性疾病的疫苗储备时，这特别是个问题。另外，一些病毒是在细胞培养系统中产生的，这为预防流行性疾病提供了更大的可扩展性选择。然而，并非所有的病毒在现有的细胞系中都能良好复制，并因此通常不能以用于成本有效的疫苗生产的足够的滴度进行复制。此外，相同病毒的不同毒株在相同的细胞系中具有不同的复制效率，这可限制所产生的疫苗的量并在病毒复制低的情况下增加疫苗生产的成本。

因此，需要开发用于产生用于疫苗生产的病毒的改进的方法和细胞群。具体地，需要增加现有细胞系中的病毒产生并开发新的细胞系用于产生高病毒产量，并且适合快速扩大规模以满足针对新出现的流行性疾病和预防流行性疾病的疫苗生产的需求。正是在这种背景下，本发明人开发了用于在体外复制病毒的方法和细胞群。

发明内容

本发明人已经证明，降低体外细胞中的抗病毒基因的表达和/或细胞中抗病毒蛋白质活性的水平可增加细胞中的病毒产生。

因此一方面，本发明提供了一种复制病毒的方法，所述方法包括：

1)获得具有遗传学修饰的细胞群，与缺乏遗传学修饰的同基因细胞相比所述遗传学修饰降低了细胞中的抗病毒基因的表达，

2)用病毒体外接种细胞，并且

3)培养细胞一段预定的时间以复制病毒，

其中与同基因细胞群相比，所述细胞能够产生更多的病毒。

在一个实施方案中，遗传学修饰位于细胞的基因组中。在一个实施方案中，基因组对于遗传学修饰是纯合性的。在一个实施方案中，遗传学修饰位于线粒体DNA(mtDNA)或核DNA中。在一个实施方案中，将遗传学修饰引入100％的细胞群中。

遗传学修饰可以是对天然存在的细胞的任何改变，其实现了降低细胞群中的抗病毒基因的表达和/或抗病毒蛋白质活性的水平的期望效果。

在一个实施方案中，遗传学修饰是抗病毒基因或其调节区内的缺失、取代或插入。例如，可通过可编程核酸酶引入遗传学修饰。在另一个实施例中，可通过同源重组引入遗传学修饰(诸如通过缺失部分或全部抗病毒基因、将外源性多核苷酸插入抗病毒基因、或重排一些抗病毒基因(诸如外显子)的方向)，从而使其不再编码具有抗病毒活性的蛋白质。在另一个实施方案中，通过非同源性末端接合来引入遗传学修饰。在又一个实施方案中，通过化学诱变剂引入遗传学修饰。

在一个实施方案中，遗传学修饰是点突变。

在一个实施方案中，通过转基因引入遗传学修饰，该转基因编码降低细胞群中的抗病毒基因的表达和/或抗病毒蛋白质活性的水平的多核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于反义多核苷酸、有义多核苷酸、微小RNA、编码与所述抗病毒基因编码的蛋白质结合的多肽的多核苷酸、转座子、适体、双链RNA分子或从其衍生的经加工的RNA分子。