[发明专利]单细胞转录组的分析方法

权利要求书

1.一种用于捕获和条形码化单细胞核酸的方法，其包括：

a)提供包含在多个区室内的多个细胞，至少一些所述区室包含单细胞、逆转录酶和至少一种寡核苷酸，其中，所述至少一种寡核苷酸包含条形码序列和引物序列，其中，每个不同的引物序列限定出不同的寡核苷酸种类，并且其中，所述多个区室中的区室包含的一个或多个条形码序列可与包含在所述多个区室中的其他区室内的条形码序列区分开；

b)裂解区室内的至少一些细胞以从细胞中释放核酸；

c)在至少一些区室中将至少一些所释放的核酸与所述寡核苷酸杂交；

d)在至少一些区室中使用所述引物序列将与所述寡核苷酸杂交的所述释放的核酸逆转录；

其中，所述多个区室具有小于3nL的体积。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述区室中每种寡核苷酸的浓度为至少100nM。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤a)进一步包括提供包含在所述多个区室内的多个颗粒，并且其中，至少一些所述区室还包含颗粒。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述至少一种寡核苷酸与所述颗粒结合。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述多个区室的体积等于或小于1nL。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其还包括在至少一些所述区室中回收通过逆转录产生的单细胞cDNA。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个条形码序列从其他细胞释放的核酸中独特地识别出由单细胞释放的所述核酸。

8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述至少一种寡核苷酸包含选自由poly-T序列、随机DNA序列和基因特异性序列组成的组的引物序列。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述引物序列是基因特异性序列，并且所述基因选自由以下组成的组：抗体重链可变基因、抗体重链恒定基因、抗体轻链可变基因、抗体轻链恒定基因、αT细胞受体基因、βT细胞受体基因及δT细胞受体基因和γT细胞受体基因。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述颗粒以不超过约1个颗粒/区室包含在所述区室中。

11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，与包含在一个区室中的颗粒结合的不同种类的寡核苷酸包含相同的条形码序列。

12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其包括在裂解细胞之前或之后从所述颗粒上释放至少一些所述寡核苷酸。

13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述区室是液滴，并且所述多个区室是多个液滴。

14.多个区室，其中，至少一些所述区室包含(i)单细胞或包含核酸的单细胞裂解物和(ii)至少一种寡核苷酸，和(iii)逆转录酶，其中，所述至少一种寡核苷酸包含条形码序列和引物序列，其中，每个不同的引物序列限定出不同的寡核苷酸种类，并且其中，所述多个区室中的区室包含的一个或多个条形码序列可与包含在所述多个区室中的其他区室内的条形码序列区分开；

其中，所述多个区室具有小于3nL的体积。

15.如权利要求14所述的多个区室，其中，所述区室中每种寡核苷酸的浓度为至少100nM。

16.如权利要求14或15所述的多个区室，其中，至少一些所述区室还包含(iv)颗粒。

17.如权利要求14～16中任一项所述的多个区室，其中，所述多个区室的体积等于或小于1nL。