[发明专利]肽片段的制备方法和其中所使用的蛋白酶的制备方法、以及肽片段制备用试剂盒

权利要求书

1.一种肽片段的制备方法，其通过使Fc结构域被固定在多孔体的细孔内的抗体与被固定在微粒的表面的蛋白酶接触而通过所述蛋白酶位点特异性地切断所述抗体的Fab结构域，

所述蛋白酶为混入有胰凝乳蛋白酶的来自动物的胰蛋白酶，

所述胰凝乳蛋白酶已失活，所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行了化学修饰。

2.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，

所述胰凝乳蛋白酶由于在组氨酸残基上结合N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮而失活。

3.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，

所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基被二甲基化。

4.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，

所述微粒的平均粒径比所述多孔体的平均细孔径大。

5.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，

所述多孔体的平均细孔径为30～150nm，所述微粒的平均粒径为100nm以上。

6.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，

所述多孔体的表面包覆有蛋白A或蛋白G。

7.一种肽片段制备用试剂盒，其为在权利要求1～6中任一项所述的方法中使用的肽片段制备用试剂盒，

其含有在表面固定有蛋白酶的微粒，

所述蛋白酶为混入有胰凝乳蛋白酶的来自动物的胰蛋白酶，

所述胰凝乳蛋白酶已失活，所述胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行了还原烷基化。

8.根据权利要求7所述的肽片段制备用试剂盒，

其还含有能够在细孔内选择性固定抗体的Fc结构域的多孔体。

9.一种蛋白酶的制备方法，其为制备在权利要求1～6中任一项所述的方法中使用的蛋白酶的方法，具有：

通过使来自动物的胰蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂反应而使混入到胰蛋白酶中的胰凝乳蛋白酶失活的步骤；和

通过使用烷基化剂和还原剂的还原烷基化而对胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基进行烷基化的步骤，

所述还原烷基化中使用的烷基化剂的合计量为胰蛋白酶的200摩尔倍以上。

10.根据权利要求9所述的蛋白酶的制备方法，其中，

所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮。

11.根据权利要求9所述的蛋白酶的制备方法，其中，

所述烷基化剂为甲醛。

12.根据权利要求9所述的蛋白酶的制备方法，其中，

在实施胰凝乳蛋白酶失活和胰蛋白酶的赖氨酸残基的氨基的烷基化后，利用亲和层析进行纯化。