[发明专利]用于富集生物分子并且用于从生物样品中去除这些生物分子的方法

说明书

本发明涉及一种用于富集生物分子并且用于从生物样品中去除这些生物分子的方法，其特征在于，‑在存在颗粒的情况下‑将生物样品与藻酸盐溶液以及二价或多价阳离子盐或者酸混合，其中在这些颗粒上形成藻酸盐凝胶‑生物分子络合物，通过分离这些颗粒将该络合物从该样品中去除，随后从该络合物中释放这些生物分子或者这些生物分子的内含物质。这些应富集的生物分子包括无细胞核酸、病毒或者亚细胞微粒。该方法与专利文件DE 10 2008 023 297 B4中说明的方法相比是一种改进的、更简单的方法。

本发明的主题是一种用于富集生物分子并且用于从样品中去除(分离)这些生物分子的简单方法，以便后续研究或进一步处理这些生物分子。这些应富集的生物分子包括无细胞核酸、病毒或者亚细胞微粒(例如外泌体)。该方法与专利文件DE 10 2008 023 297B4中说明的方法相比是一种改进的、更简单的方法。

已知在无细胞体液中存在所谓的游离循环核酸、外泌体以及在病毒感染的情况下还存在病毒颗粒。所有这些不同的生物分子对于疾病诊断均有重大意义。尤其无细胞核酸以及外泌体在此所起的作用越来越重要。对于所有这些生物分子而言的共性是，它们仅以很小的浓度存在于体液中。这就给它们的诊断用途造成困难。唯一的出路在于处理更大的样品体积，以便最终有足够量的生物分子可供使用。例如血浆、血清或者还有尿液的体液均可考虑作为重要的初始样品。

目前只有少数方法允许从大体积的样品中富集或分离生物分子或者随后将所富集的生物分子用于提取核酸。

例如使用超离心技术来从生物样品中富集外泌体。此时外泌体聚集在反应容器的底部。这种方法必须与超离心机相关，并且除此之外还费时且不适用于例行诊断。此外还使用超滤技术。该方法也费时并且非常昂贵。替代的方法在于借助免疫板或者借助免疫珠实现外泌体的免疫沉淀。这种富集外泌体的方式也费时，并且因为所使用的反应试剂而易受干扰且昂贵。除此之外，在该技术中只能使用200至500μl的样品。病毒的富集同样可以使用超离心技术。替代的方法在于借助聚乙二醇/氯化钠使病毒颗粒沉淀以及随后的离心(Yamamoto et al，Virology 40(1970)734；Morandi et al，J.Clin.Microbiol.36(1998)1543-1538)。在此使用PEG和氯化钠的不同混合物，并且将这些反应试剂与生物样品混合。随后将混合物低温培养较长时间，接着通过离心获得病毒(蛋白质)-NaCl/PEG-沉淀物。这些方法也很麻烦并且需要很多时间。除此之外，继续处理沉淀物以便分离病毒核酸也是有问题的。常常很难使沉淀物重新进入溶液。这显著影响核酸分离的效率和质量。专利文件DE19856415 C2描述了一种方法，该方法使用已知的NaCl/PEG沉淀过程来工作，其中随后以本身已知的方式通过键合到硅酸盐型固相来实现核酸的分离。尚不清楚该方法与具有已知问题的充分已知的NaCl/PEG沉淀方法有多少差别。除此之外，该方法还需要低温培养以及二十分钟的离心。该方法应当可以从最多10ml的样品中分离病毒核酸。应允许处理最多1ml样品的另一种可商购的变体基于在使用特殊洗涤剂的情况下富集病毒核酸。在此利用裂解反应试剂对样品进行的初始培养导致病毒裂解。随后形成“洗涤剂-核酸络合物”。将混合物离心并且随后对所获得的丸状物进行蛋白分解处理，并且进而以本身已知的方式通过结合到硅酸盐型固相来分离核酸(QIAamp UltraSens Virus Handbook)。此处也强调了与重新悬浮丸状物相关的问题。除此之外，该方法也只能处理具有最多1ml体积的样品。

为了从大体积的样品中分离循环的无细胞DNA，只能将进行提取所需的所有缓冲液成分按比例增大。本领域技术人员已知，这伴随着巨大的反应试剂以及时间耗费。

本领域技术人员也很清楚，如果想要将样品中的生物分子增浓或纯化，那么对于不同的生物分子(例如病毒、DNA或者亚细胞颗粒)也总是需要不同的方法。

专利文件DE 10 2008 023 297B4中公开了一种用于从生物样品中浓缩生物分子并且用于随后提取核酸的全新手段。