[发明专利]通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其C5-C10化合物的方法

权利要求书

1.一种制备C₇-C₁₁ 2-酮酸的方法，所述方法包括：(I)提供C₄-C₁₀ 2-酮酸底物中的至少一种与

(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶；

(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶；和

(C)至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物，其包括：

(1)LeuC亚基，其选自由以下组成的群组：

(i)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和

(ii)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合；和

(2)LeuD亚基，其选自由以下组成的群组：

(i)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和

(ii)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合；

在所述C₄-C₁₀ 2-酮酸底物中的至少一种转化为所述C₇-C₁₁ 2-酮酸的条件下；

其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(i)和(I)(C)(2)(ii)的组合、(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(ii)的组合、或(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(i)的组合；其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性；以及其中所述C₄-C₁₀ 2-酮酸底物中的至少一种通过一种或多种生化反应转化为所述C₇-C₁₁2-酮酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：

(a)丙氨酸取代Val-35；

(b)甘氨酸取代Val-35；

(c)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；

(d)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；

(e)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411；以及

(f)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：

(a)丙氨酸取代Leu-31；

(b)甘氨酸取代Leu-31；

(c)缬氨酸取代Leu-31；

(d)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；

(e)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；

(f)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；以及

(g)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(i)和(I)(C)(1)(ii)的组合，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(1)(ii)的组合，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。