[发明专利]骆驼科抗体可变区免疫组库构建的引物组合及应用

权利要求书

1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合中包括可以特异性退火结合到骆驼科抗体V基因I家族（Clan I）的前导区的第一上游引物和下游引物，其中所述第一上游引物包含以下引物序列：SEQ ID NO. 11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、和44，所述引物组合还包括特异性退火结合到骆驼科抗体V基因III家族（Clan III）的前导区的第二上游引物和下游引物，所述第二上游引物序列如SEQ ID NO.46所示，所述引物组合还包括特异性退火结合到骆驼科抗体V基因II家族（Clan II）的前导区的第三上游引物和下游引物，所述第三上游引物序列如SEQ ID NO.53所示，并且所述下游引物序列如SEQ IDNO.45所示；

并且所述引物组合中还包括特异性退火结合到骆驼科抗体J基因区域的下游引物和上游引物，所述下游引物的序列如SEQ ID NO. 54、55、56、和57所示，所述上游引物序列如SEQID NO.58所示。

2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含扩增传统抗体重链可变区VH的上游引物和下游引物，所述上游引物为以V基因区域引物，序列为SEQ ID NO.51，所述下游引物为以J基因区域引物，序列为SEQ ID NO.47、48、50。

3.一种包含权利要求1所述的引物组合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒，任选地包含PCR扩增试剂。

4.一种使用权利要求1所述的引物组合构建骆驼科抗体可变区免疫组库的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)第一轮扩增

提供骆驼科动物免疫细胞的核酸作为模板，使用引物组合进行第一轮PCR扩增，获得第一轮扩增产物，所述引物组合中包括可以特异性退火结合到骆驼科抗体V基因I家族（ClanI）的前导区的第一上游引物和下游引物，其中所述第一上游引物包含以下引物序列：SEQID NO. 11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、和44，所述引物组合还包括特异性退火结合到骆驼科抗体V基因III家族（Clan III）的前导区的第二上游引物和下游引物，所述第二上游引物序列如SEQ ID NO.46所示，所述引物组合还包括特异性退火结合到骆驼科抗体V基因II家族（Clan II）的前导区的第三上游引物和下游引物，所述第三上游引物序列如SEQ ID NO.53所示，并且所述下游引物序列如SEQ ID NO.45所示；

(2)第二轮扩增

以第一轮扩增产物为模板，以引物组合进行第二轮巢式PCR扩增，获得第二轮扩增产物，所述引物组合中包括特异性退火结合到骆驼科抗体J基因区域的下游引物和上游引物，所述下游引物的序列如SEQ ID NO. 54、55、56、和57所示，所述上游引物序列如SEQ IDNO.58所示。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的核酸为细胞来源的RNA反转录成的cDNA。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括任选地步骤：

(3)以所述第二轮扩增产物为模板进行illumina文库构建。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，扩增完成后，回收600-1100bp的基因片段作为所述第一轮扩增产物。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩增完成后，回收300-600bp的基因片段作为所述第二轮扩增产物。