[发明专利]全基因组数字扩增的方法

说明书

本公开提供了一种用于基因组DNA扩增的方法，如全基因组扩增，包括使用转座酶系统制造包含引物结合位点的基因组DNA的片段，在油中分离在其自身水性微滴内的各片段以及PCR扩增试剂，扩增在其自身水性微滴内的各片段，使微滴反乳化以获得扩增子，并对扩增子进行测序。

政府权益的声明

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的5DP1CA186693下于政府资助下完成。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

发明领域

本发明的实施方式通常涉及用于扩增痕量DNA(如来自单个细胞的DNA)的方法和组合物，从而检测其基因序列，特别是整个基因组。

背景技术

在细胞间变异和种群异质性起关键作用的研究中，如肿瘤生长、干细胞重编程、胚胎发育等，进行单个细胞基因组测序的能力非常重要。当进行测序的细胞样品非常珍贵或稀有或以微量存在时，单个细胞基因组测序也同样非常重要。准确的单个细胞基因组测序的重要之处在于基因组DNA(可以是处于微量的)的初始扩增。

多重置换扩增(MDA)是在测序和其它分析之前用于单个细胞基因组DNA领域的常用方法。在该方法中，随机引物退火后，利用具有强链置换活性的DNA聚合酶进行延伸。来自单个细胞的原始基因组DNA以级联样的形式指数地扩增，以形成超支化DNA结构。扩增来自单个细胞的基因组DNA的其它方法述于Zong,C.,Lu,S.,Chapman,A.R.,和Xie,X.S.(2012),单个人细胞的单核苷酸和拷贝数变异的基因组范围检测(Genome-wide detection ofsingle-nucleotide and copy-number variations of a single human cell),Science338,1622-1626，其中描述了多重退火和基于环型的扩增循环(MALBAC)。本领域所知的另一方法是简并寡核苷酸引发的PCR或DOP-PCR。用于单个细胞基因组DNA的若干其他方法包括：Cheung,V.G.和S.F.Nelson,使用简并寡核苷酸的全基因组扩增允许成百上千个基因型以少于一纳克的基因组DNA进行(Whole genome amplification using a degenerateoligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on lessthan one nanogram of genomic DNA),Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,1996.93(25):14676-9页；Telenius,H.,等,简并寡核苷酸引发的PCR：通过单个简并引物的常规扩增(Degenerateoligonucleotide-primed PCR:general amplification of target DNA by a singledegenerate primer),Genomics,1992.13(3):718-25页；Zhang,L.,等,单个细胞的全基因组扩增：对基因分析的启示(Whole genome amplification from a single cell:implications for genetic analysis).Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,1992,89(13):5847-51页；Lao,K.,N.L.Xu,和N.A.Straus,使用单个引物的PCR的全基因组扩增(Whole genome amplification usingsingle-primer PCR),Biotechnology Journal,2008,3(3):378-82页；Dean,F.B.,等,使用多重置换扩增的完整人基因组扩增(Comprehensive human genome amplification usingmultiple displacement amplification),Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2002.99(8):5261-6页；Lage,J.M.,等,使用超支化链置换扩增和列阵-CGH对小DNA样品中基因变异的全基因组分析(Whole genomeanalysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranchedstrand displacement amplification and array-CGH),Genome Research,2003,13(2):294-307页；Spits,C.,等,单个细胞全基因组置换扩增的优化和评价(Optimization andevaluation of single-cell whole-genome multiple displacement amplification),Human Mutation,2006,27(5):496-503页；Gole,J.,等,使用纳升微管进行单个细胞大规模平行聚合酶克隆和基因组测序(Massively parallel polymerase cloning and genomesequencing of single cells using nanoliter microwells),Nature Biotechnology,2013.31(12):1126-32页；Jiang,Z.,等,使用多重置换扩增的单个精子的基因组扩增(Genome amplification of single sperm using multiple displacementamplification),Nucleic Acids Research,2005,33(10):e91页；Wang,J.,等,人精子细胞中重组活性和新生突变比例的基因组范围单个细胞分析(Genome-wide Single-CellAnalysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in HumanSperm),Cell,2012.150(2):402-12页；Ni,X.,肺癌患者单循环肿瘤细胞中可再生拷贝数变异模式(Reproducible copy number variation patterns among single circulatingtumor cells of lung cancer patients),PNAS,2013,110,21082-21088；Navin,N.,通过单个细胞测序推测肿瘤进化(Tumor evolution inferred by single cell sequencing),Nature,2011,472(7341):90-94；Evrony,G.D.,等,人大脑中11个反转录转座和体细胞突变的单个神经元测序分析(Single-neuron sequencing analysis ofl1retrotransposition and somatic mutation in the human brain),Cell,2012.151(3):483-96页；和McLean,J.S.,等,使用高通量单个细胞基因组学平台从医院槽中的生物膜中回收牙龈卟啉单胞菌病原体的基因组(Genome of the pathogen Porphyromonasgingivalis recovered from a biofilm in a hospital sink using a high-throughput single-cell genomics platform),Genome Research,2013.23(5):867-77页。关于全基因组扩增方面的方法报道于WO 2012/166425、US 7,718,403、US 2003/0108870和US 7,402,386。