[发明专利]糖链解析方法

说明书

使用具有一个容易带负电的部位的2‑氨基苯甲酸等标记试剂来对具有分支结构的糖链进行标记。此时，不进行在基于还原氨基化的标记中通常实施的还原。制备包含如此得到的糖链标记体的质谱分析用样品，针对该样品以负离子模式执行MS/MS分析。由此得到的MS/MS谱中，明显地出现反映出分支结构的E离子、D离子等的峰。由此，能够容易地进行包含分支结构的糖链整体的结构解析。

技术领域

本发明涉及利用质谱分析来解析糖链的结构的方法，尤其涉及在具有分支结构(也称为树状结构)的糖链的结构解析中有用的方法。

背景技术

认为构成生物体的蛋白质的一半以上受到了糖链修饰，糖链修饰在蛋白质的结构、功能的调节中发挥重要的作用。另外，通过近年来的研究，已知在细胞表面上表达的糖链参与细胞间相互作用、信号传递、发育/分化、进而受精、癌症转移等各种各样的生物体内现象。

修饰蛋白质的糖链很少是单糖以直链状连接而成的结构，在大多的情况下具有分支结构。这种具有分支结构的糖链的结构非常富有多样性，其结构对蛋白质的功能产生重大影响。因此，糖链的结构解析在生理学、生命科学、医学等各种领域中是重要的。

近年来，糖链的结构解析中，广泛利用了质谱分析、特别是被称为串联质谱分析、多级质谱分析(MSⁿ)等的伴有针对离子的解离操作的质谱分析。使用质谱分析的糖链结构解析通常基于在正离子模式下获取的质谱(本说明书中，有时通过MS/MS分析得到的MS/MS谱等也称为质谱)来进行。但是，若使正离子化的糖链通过碰撞诱导解离(CID)法解离，则往往在单糖间的糖基键处发生解离，难以得到分支结构的信息。因此，这种方法在推定构成糖链的单糖时是有用的，但不太适于具有分支结构的糖链的结构解析。

与此相对，虽然不太常规，但也尝试了基于在负离子模式下获取的质谱的糖链结构解析。

已知，若使负离子化的糖链通过CID解离，则反映分支结构的解离容易特异性地发生。例如N型糖链中，分别容易生成反映二条分支中的1-6臂的结构信息的D离子、反映1-3臂的结构信息的E离子，通过检测这些离子而能够推定分支结构。而且，这些产物离子被认为是通过单纯的一次断裂而生成的，具有如下特性：与通过复杂的二次断裂或三次断裂而生成的离子相比，原分子的结构信息容易直接反映于产物离子。因此，例如在质谱上观测到某个特定的产物离子的情况下，具有能够进行唯一确定原分子的部分结构的诊断性解析的优点。由此，可以说负离子模式下的质谱分析在具有分支结构的糖链的结构解析中是有利的。

然而，原本糖链就有难以负离子化的问题。作为单糖之一的唾液酸具有羧基，因此容易带负电荷。因此，包含唾液酸的酸性糖链比较容易成为负离子，但是，在实际测定中也往往为了防止唾液酸的损失而通过前处理进行衍生物化，使得唾液酸部分的负电荷被中和。因此，通常即使在糖链中包含唾液酸的情况下，也需要使实质上不具有会发生去质子化的官能团的中性糖链进行负离子化。

作为使中性糖链进行负离子化的一个方法，开发了通过在糖链分子上加成阴离子从而进行负离子化的方法。例如专利文献1、非专利文献1中公开了，为了使实质上为中性的糖链通过基质辅助激光解吸离子化(MALDI)法进行负离子化而在特殊的液体基质中添加阴离子来制备测定用样品的方法。液体基质例如为由胺的离子与对香豆酸等的含酸性基团有机物质的离子形成的离子性液体，阴离子为四氟硼酸等。然而，这种方法中，能够使用的基质的种类相当受限制，无法利用MALDI用的常规的、即能够容易廉价购入的基质。另外，这种特殊的基质根据质谱分析装置的种类而有时不适合。例如，液体基质在通常的基质辅助激光解吸离子化飞行时间型质谱分析装置(MALDI-TOFMS)中有时因基质自身的厚度、其他的影响而导致分辨率降低。因此，优选在TOFMS的前级设置的质谱分析装置中使用后述离子阱。另外，根据糖链的种类，即使添加的阴离子的种类相同，也有时完全得不到产物离子，因此阴离子的选择也是困难的。另外，也有如下的问题：在糖链上加成的阴离子与该糖链之间形成共价键，因此有时得不到对结构解析有用的诊断性的产物离子。