[发明专利]一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试纸

说明书

本发明涉及临床肝素诱导的血小板减少症(HIT)检测的技术领域，具体涉及了一种免疫微球层析肝素/血小板因子4抗体检测试纸。包括如下步骤：制备抗体复合物；试纸条载体膜的准备，蛋白A乳胶颗粒制备,反应垫的制备、样品垫标记、分离膜组装、试纸条的组装、临床样本检测,并将干燥的试纸条置于铝箔袋内。本发明HIT抗体的侧流免疫检测方法具有较高成本效益，并定量检测和评估HIT抗体在患者的体液中的水平。该方法用于POCT检测系统，以及筛选或检测患者体液中HIT抗体的滴度变化以确定对HIT敏感的检测方法，能够使HIT抗体检测技术成为临床常规检测项目。

技术领域

本发明涉及肝素诱导的血小板减少症检验技术领域，尤其涉及一种免疫微球层析快速HIT抗体检测试试纸制备方法。

背景技术

HIT是一种抗体介导的综合征，有较高的发病率和致死率，过去由于很多医生没有足够的认识及难以确诊常被认为是一种罕见疾病。并且除了肝素外也无更好的治疗手段。HIT的发病率高低主要与肝素使用时间，肝素类型，使用途径，患者类型，性别及人种等因素相关。

有关HIT的发病机制还不是很明确，目前普遍认为是血循环中出现肝素样化合物时，PF4(血小板因子4)即以高亲和力与之结合，形成肝素-PF4(H-PF4)复合物(肝素失去活性)。H-PF4复合物形成后，其构象发生改变(松散，在第3、4个半胱氨酸残基间暴露出多个抗原表位，机体内发生免疫反应，产生免疫球蛋白IgG，IgA,IgM)——IgG-H-PF4复合物。IgG-H-PF4复合物结合到血小板膜受体上——大量血小板激活和聚集及血小板数量下降。血小板广泛激活后，其囊泡内颗粒释放——激活凝血系统，凝血酶形成增加。活化的血小板与凝血因子相互作用——血栓形成。

HIT与其它原因诱导产生的血小板减少症相比，HIT患者血小板计数常>20*10^9.发作时间在使用肝素后5～14天。

HIT的主要并发症不是因血小板减少导致的出血性疾病，而是因血小板抗体原因机体处于高凝状态，病理性血栓形成。且动脉血栓栓塞发生率极高。另外，HIT有50％的风险会导致一系列的并发症，血栓多发生于静脉。例如双下肢深部静脉血栓形成、肺栓塞、肢端静脉坏疽fingers,toes,penis,or nipples、心梗、卒中、肠系膜动脉血栓、四肢局部缺血及截肢(Circulation 1999；100:587-93)。

另外，部分患者局部肝素注射部位可出现痛性红斑或皮肤坏死。急性血小板激活(寒战、肌痛、发热、心动过速、大汗及恶心等，罕见症状有急性一过性遗忘。)HIT相关死亡率约为18％。但是，正确的管理可以减少发病率和死亡率。

HIT目前尚无确诊方法。但目前常用的方法为根据临床表现进行4TS评分(表1)评估结合实验室检查排除HIT阴性患者，Warkentin通过血小板计数、发生时间、血栓情况以及血小板的可能原因四个因素设计了简明4Ts评分表，经过不断演变和大量研究验证，高概率(评分6～8分)阳性预测值为0.64；低概率(评分≤3分)阴性预测值为0.998。用于初步排除可疑HIT被广泛应用于临床，并得到指南推荐。

由于目前HIT阳性确诊较为困难，因此，快速，高NPV的PF4-H检测作为阴性排除手段则显得尤其重要！

目前西方国家采用的HIT抗体检测试剂主要为ELISA方法，该方法在国外临床筛查中非常普及，但由于需要专业的检测人员，操作复杂，耗费时间长，阳性预测值不高。流式细胞术HITKit和SRA放射免疫方法产品因临床操作复杂，检测报告时间过长，临床普及程度较低，HemosIL公司的免疫比浊法HIT-Ab(PF4-H)经过临床实践后，具有很好的实验室应用价值，但是该方法为大型凝血仪检测项目，不适合用于床旁POC，临床需要更便捷快速的方法进行检测，Stago公司的STic Expert和Akers Biosciences公司的PIFAPlussPF4^TM可用于临床快速POCT检测，但是HIT抗体没有被定量检测，临床检测敏感度低。