[发明专利]基于duplex-seq的超低频突变位点检测分析方法

说明书

本发明公开的一种基于duplex‑seq的超低频突变位点检测分析方法，包括如下步骤：1)对原始测序数据质量进行评估，降低数据噪声，为后续分析提供有效数据；2)把随机barcode提取到序列文件的每一条序列的标题行，方便后续对barcode进行快速检索并创建一致性序列；3)根据family barcode和duplex barcode创建一致性序列，排除由于建库过程或者PCR过程中引入的突变；4)根据duplex‑tag构建双链一致性序列，进一步排除序列中的非对称突变位点；5)对比对后的数据进行局部质量矫正，并进行低频变异位点检测；将变异位点进行基因结构、功能、及临床表型三个层次的注释；6)统计SSCS、DCS序列数目、比对结果、变异位点信息，并输出可视化图表。

技术领域

本发明属于生物信息数据处理方法，特别涉及一种基于duplex-seq的超低频突变位点检测分析方法，其主要应用与第二代高通量测序领域，基于duplex-seq全外显子组测序，对ctDNA的超低频变异位点进行检测分析。

背景技术

下一代测序技术的发展如火如荼，其正在以势如破竹的力量深刻变革着传统遗传学的研究，并因此催生了精准医学的萌芽。相比与传统的实验技术，该技术可以一次性检测成千上万的遗传突变。然而美中不足的是下一代测序技术仍然存在相对较高的错误率(0.1～1％)。对于高频的遗传突变检测，这个错误是可以接受的，但是对于一些低频突变的检测，该测序方法存在很大的局限性。

低频突变的检测现在应用越来越广泛，特别是在肿瘤细胞的检测中的应用倍受关注。肿瘤组织中出现突变的细胞比例小于1％，对于这样的低频突变，一般的方法很难检测到。因此有学者提出了双重标记的测序方法(Duplex Sequencing，Duplex-seq)(KennedySR,Schmitt MW,Fox EJ,Kohrn BF,Salk JJ,Ahn EH,et al.Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.Nature protocols.2014；9:2586-606.)和(Newman AM,Bratman SV,To J,Wynne JF,Eclov NC,Modlin LA,et al.Anultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broadpatient coverage.Nature medicine.2014；20:548-54.)。该方法能应用于任何双链DNA样本，通过对双链加入随机的双重标签序列，使得每条链都具有唯一的分子标记序列(UniqueMolecular index，UMI)，可来排除由于建库过程或者测序过程中引入的误差。对于此类测序数据的分析方法已有相关报道(Newman AM,Lovejoy AF,Klass DM,Kurtz DM,ChabonJJ,Scherer F,et al.Integrated digital error suppression for improveddetection of circulating tumor DNA.Nature biotechnology.2016；34:547-55)，但是都存在一定的不足，因此，本发明拟通过开发新的方法来对Duplex-seq测序数据进行更加系统专业的分析，以用来指导相关疾病患者在临床中选择更好的药物和剂量，达到精准、高效治疗的目的，以及对健康人群的患病风险的评估提供更为准确的参考。

Duplex-seq技术在高通量测序已得到广泛应用，基于Duplex-seq对低频突变位点进行检测的分析方法也越来越多，但是目前存在以下几点问题：

1.数据质量控制：现有Duplex-seq的数据分析方法流程中，未见对前期数据质量的系统分析，如数据重复率、UMI的种类、数量、比例、R1R2的平衡性等。

2.UMI的差异分析：现有Duplex-seq数据分析方法中对于单链特异性UMI和双链互补的UMI的综合和独立分析还未见报道。