[发明专利]一种红嘴相思鸟核基因引物及其测序方法和应用

说明书

本发明公开了一种红嘴相思鸟核基因引物及其测序方法和应用，所述引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，所述第一引物对包括序列号为SEQ ID NO.1的RAG‑F1‑17和序列号为SEQ ID NO.2的RAG‑R1‑533；所述第二引物对包括序列号为SEQ ID NO.3的RAG‑F2‑996和序列号为SEQ ID NO.4的RAG‑R2‑2024；所述第三引物对包括序列号为SEQ ID NO.5的RAG‑F3‑1945和序列号为SEQ ID NO.6的RAG‑R3‑2779。本发明所得到的引物有着非常好的扩增功能，对红嘴相思鸟核基因rag1的扩增，最后均能获得明亮的条带，有利于后续研究大规模用该引物进行扩增。

技术领域

本发明属于鸟类系统发育技术领域，具体涉及一种红嘴相思鸟核基因引物及其测序方法和应用。

背景技术

核基因重组激活基因(RAGs)的编码产物rag1和rag2组成最重要的重组酶，能特异地识别Ig和TCR的V、DH、J基因片段两侧的RSS，并催化DNA双链断裂，引起V(D)J重排，是Ig和TCR库多样性的主要原因。rag1或rag2发生的错义突变可使其编码的重组酶活性部分丧失，V(D)J重组发生倾向性改变，导致早期淋巴细胞发育被阻断而使循环中T、B细胞缺失，而引起一类严重的联合免疫缺陷，临床上称为Omenn syndrome(OS)。目前在系统进化中主要以基因作为分子标记，但大多数利用线粒体基因来研究物种的分类和进化，但是与线粒体基因相比，核基因包含有更加丰富的生物信息学信息，因此一般会联合核基因来展开研究。因此，核基因rag1作为非常重要的重组酶编码基因，同时也可以用来探究鸟类的系统发育问题。

红嘴相思鸟(Leiothrix lutea)又称相思鸟、红嘴鸟等，因嘴赤红色而得名。画眉科相思鸟属两种鸟之一，是海拔迁徙的候鸟。羽色艳丽，体态娇小玲珑，鸣声响亮悦耳，为国内外名贵的笼鸟，是我国传统的出口鸟类，具有较高的经济价值。

在研究雀形目相思鸟科系统发育关系及核基因rag1相关研究时，用上述基因通用引物扩增红嘴相思鸟相应基因，结果得不到扩增结果或者产生了非特异性扩增出现多条带现象，无法进行后续研究。虽然上述基因有诸多优势，但是在红嘴相思鸟中表现出局限性，限制了利用该基因对于红嘴相思鸟的相关研究。因此，快速而又准确的得到红嘴相思鸟核基因rag1序列尤其重要。

现有技术中，利用通用引物扩增核基因序列，可能出现扩增不出来或是非特异性扩增的情况。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种红嘴相思鸟核基因引物及其测序方法和应用，利用特异性红嘴相思鸟核基因rag1引物，快速、准确的扩增出基因序列。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种红嘴相思鸟核基因引物，所述引物包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，所述第一引物对包括序列号为SEQ ID NO.1的RAG-F1_17和序列号为SEQ ID NO.2的RAG-R1_533；所述第二引物对包括序列号为SEQ ID NO.3的RAG-F2_996和序列号为SEQ IDNO.4的RAG-R2_2024；所述第三引物对包括序列号为SEQ ID NO.5的RAG-F3_1945和序列号为SEQ ID NO.6的RAG-R3_2779。

本发明还提供一种红嘴相思鸟核基因引物的测序方法，包括如下步骤：

(1)提取红嘴相思鸟总基因组；

(2)采用核基因rag1三对通用引物对红嘴相思鸟总基因组进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)扩增后的产物片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，并经过纯化后进行测序，得到三个基因片段；

(4)对测序结果进行拼接，得到2700bp的基因片段；

(5)筛选测序序列进行引物设计，得到所述红嘴相思鸟核基因引物；