[发明专利]液相色谱-串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法及结直肠癌诊断试剂盒

说明书

本发明提供一种液相色谱‑串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法及结直肠癌诊断试剂盒，将组织样本在液氮中研磨成粉，将组织粉末用含有BHT的冰甲醇均质，离心；向上清液中加入内标，用正丁醇于生处理，用流动相重新分散溶解，得到待上样检测样品；对待上样检测样品利用液相色谱‑串联质谱法进行分析，得到组织样本中亚油酸的含量。另外，进一步对亚油酸通路的代谢酶进行表达分析，结果提示亚油酸通路中FADS1，FADS2，ELOVL2以及ELOVL5的基因表达都增加。本发明通过对结直肠癌患者的肿瘤组织与正常组织亚油酸含量变化以及相关代谢通路中基因的表达变化进行检测，为结直肠癌的诊治，以及后期的营养学支持提供重要参考。

技术领域

本发明属于肿瘤医学领域，涉及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS方法)检测肠道组织样本亚油酸含量，以及用于结直肠癌的诊断试剂盒。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer)是消化系统中常见的恶性肿瘤，其致死率在全球居第四位。虽然内镜检查有助于结直肠癌的确诊，但受制于经济条件和患者的依从性，应用范围有限。目前，癌胚抗原(CEA)常用于卵巢癌和消化道肿瘤的早期筛查，但其检测灵敏性和特异性有待提高。结肠直肠癌的诊断对于提高患者的生存率具有重要意义。

必需脂肪酸因为在体内不能合成，必须依赖于食物提供，主要包括亚油酸和亚麻酸等多元不饱和脂肪酸。亚油酸与类脂代谢有关，尤其对胆固醇的转运和代谢起着重要的作用。胆固醇在体内必须和脂肪酸结合才可以被转运和代谢。当体内缺乏必需脂肪酸时，胆固醇的转运和代谢发生异常，进而堆积以致含量增加。亚油酸与胆固醇结合生成水溶性物质，降低血清胆固醇水平，保护心脑血管。亚油酸是不饱和脂肪酸，是细胞膜的组成成分，参与线粒体及细胞膜磷脂的合成。亚油酸代谢产物是血栓素A2(TXA2)，具有促进血小板聚集和促进动脉内膜增生功能。同时，亚油酸是生物抗氧剂，具有抗老化和增加机体免疫力作用。

近期研究显示，代谢通路的变化与肿瘤的发生发展密切相关。特别是，肿瘤细胞内的亚油酸代谢通路发生了变化。明确细胞内亚油酸代谢模式有助于肿瘤的早期诊断和发生发展进程评价。因此，通过检测肠息肉、腺瘤等活检组织中的亚油酸代谢通路变化和代谢靶点，有助于对患者进行早期确诊和发病风险评估。

目前，亚油酸的检测方法主要是GC-MS。通常将亚油酸衍生为易挥发的甲酯，经过GC分离，然后进行MS检测。但在衍生过程中的水解、氧化或者异构化等问题，极易造成检测结果不准确。使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)较GC-MS有以下优点，LC条件温和，适合像亚油酸这样的极性低、低挥发性且热敏感的化合物，可避免衍生过程中的异构和氧化。但时，LC-MS/MS的衍生方法过于繁琐和耗时。因此，建立简便、快捷、准确的亚油酸检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液相色谱-串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法及结直肠癌诊断试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种液相色谱-串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法，包括以下步骤：

1)将50～110mg组织样本在液氮中研磨成粉，将研磨得到的组织粉末用含有0.1％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的冰甲醇均质后进行离心，取离心得到的上清液；

2)向15～20μL上清液中加入亚油酸同位素内标，放置25～35min后离心，将离心得到的上清液经氮气吹干后用50～60μL正丁醇于60～65℃衍生处理20～30min，然后氮气吹干，用100～150μL流动相重新分散溶解，得到待上样检测样品；

3)对待上样检测样品利用液相色谱-串联质谱法进行分析，得到组织样本中亚油酸的含量。

所述组织样本由肠道活检得到。

所述冰甲醇是指0～4℃预冷的甲醇(色谱级)。