[发明专利]应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及结直肠癌检测技术领域，具体来说是一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法。

背景技术

据国家癌症中心全国肿瘤登记数据报告，我国城市和农村地区结直肠癌发病率分别列所有恶性肿瘤的第3位及第5位，病死率分别居第4 位和第5位，我国结直肠癌的发病率亦呈逐年上升趋势，手术仍是治疗结直肠癌的主要手段，但效果并不理想。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用，EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生，EGFR存在于大多数细胞中，在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、 前列腺癌和非小细胞肺癌等，其中在结直肠癌的阳性表达率为25%〜77%。

近年来，应用靶向药物治疗癌症取得了重要进展，已证实EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-Tyrosine Kinase Inhibitors,EGFR-TKIs）在EGFR突变的肺癌患者治疗中取得确切的疗效，因此，在目前抗肿瘤分子靶向治疗中，EGFR成为靶向药物治疗结直肠癌最受关注的治疗靶点之一. EGFR基因突变常集中在细胞内的酪氨酸激酶区域，突变率最高的是19外显子的2种缺失突变（delE746-A750)和21外显子的点突变（L858R)，研究显示二者在所有 EGFR基因突变中的比例占90%以上，其中，外显子21上的L858R点突变通常是替代突变，2573位的T由G取代，导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸(CTG—CGG)，因此EGFR外显子21L858R点突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考，同时可用于癌症患者用药期间耐药性突变监测。

在结直肠癌患者中，EGFR基因突变率较高，具有重要的研究意义，但是，如何准确而有效的检测EGFR突变状态仍是一个迫切需要解决的问题，在目前诊断检测中，样本来源和检测方法是主要限制方向，现在普遍通过侵入式活组织检查法确诊，价格昂贵、复杂，既费时又费力，不能及时检查或不便多次检测，而检测方法中，PCR产物测序法虽然是公认的检测标准，但是灵敏度并不高；PCR-RFLP可用于检测基因多态性，虽然灵敏，但是由于其设计操作复杂费时，使用起来受限制；变性高效液相色谱（Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC）具有灵敏度高，检测快，高通量，且操作自动化的优点，但是由于其对检测类型有一点的选择，且成本较高，使用起来很受限制，因此，缺少一种低成本、无创、易操作且特异性高的EGFR突变检测方法。

ARMS法又称突变扩增阻滞系统，是以TaqDNA 聚合酶缺少 3`-5`外切酶活性， 不能修复扩增时引物 3`末端单个碱基的错配为基础，引物的 3`端碱基与位点等位基因互补时， 则继续扩增，当引物 3`端碱基与位点等位基因错配时，则扩增停止或者是效率严重下降，ARMS-PCR方法灵敏度不足以对血液、尿液等体液进行检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。

1999年Vogelstein和Kinzler首次提出了"数字PCR(digital PCR, dPCR)"的概念，dPCR具有极高的检测敏感性，且具有不易被PCR反应抑制剂干扰等特点，目前，dPCR技术以其极高的敏感性、绝对计数能力和无需定标等特性而在肿瘤分子诊断工作中得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的检测精确度差、灵敏度不足的缺陷，提供一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法来解决上述问题。

本发明公开了一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，具体步骤为：

步骤一、提取尿液中的DNA模板：

a、收集40ml尿液样本，在4℃、5000rpm 的条件下离心 10min，离心完成后收集底部的沉淀；

b、取1.5 ml TE 缓冲液，加入到步骤a收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm 的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；

c、另取1.5 ml TE 缓冲液，加入到步骤b收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm 的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；