[发明专利]一种提高苹果转基因材料再生效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高苹果转基因材料再生效率的方法，包括：圆叶海棠组培苗在扩繁培养基中培养一个月，将茎基部的愈伤用手术刀切下，然后将再生的茎段移植到新的培养基中；再生的茎段在扩繁培养基中培养一个月，取完全伸展的功能叶横切中脉两至三刀，农杆菌侵染后转接到预分化培养基中，暗培养2‑4天后转移到分化培养基中，暗培养2周后光下培养，直至分化出抗性芽；将抗性芽移植到继代培养基中进一步培养20‑30天；挑选株高达到1.5cm的再生植株移植到生根培养基，培养一个月进行移栽。本发明离体叶片再生效率达到80.33％，扩繁系数达到8.2，生根率达到96.38％。

技术领域

本发明属于苹果种植技术领域，尤其涉及一种提高苹果转基因材料再生效率的方法。

背景技术

近年来，基因工程的发展为苹果品种的遗传改良提供了新的技术方法，拓宽了基因源，突破了种间界限，能从动植物及微生物中分离各种功能基因用于遗传改良，缩短育种周期，提高育种效率，为苹果遗传育种研究及利用各种遗传种质资源开辟了一条新的技术途径。国外早在1991年就成功应用icp基因转化苹果，1992美国批准将携带由icp基因的转基因苹果植株进行田间试验；国内达克东等也应用cpti基因转化了皇家嘎拉。受基因的控制，有些苹果砧木在扦插和压条繁殖时，生根极为困难，为了提高M26砧木生根能力，lamber等将来自发根农杆菌ri质粒的T-DNA区导入M26中，结果携带有ri质粒的T-DNA的转化植株有良好的根系，生根能力大大提高。苹果愈伤组织再生植株尚存在较大困难，叶片再生胚状体还不够成熟且周期较长，所以，探索适用于苹果遗传转化的新材料是苹果育种工作者亟待解决的问题之一。

综上所述，现有苹果转基因材料大部分是皇家嘎啦和M26，由于其他材料的再生体系不成熟，尚未广泛推广应用，转基因材料相对单一，另一方面，苹果叶片再生能力差，再生植株的效率比较低。寻求一种再生效率高的苹果转基因材料是苹果育种工作者亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高苹果转基因材料再生效率的方法，旨在解决现有使用的苹果转基因材料是皇家嘎啦和M26，转基因材料单一，叶片再生植株的效率较低的问题。

本发明是这样实现的，一种提高苹果转基因材料再生效率的方法，所述提高苹果转基因材料再生效率的方法包括以下步骤：

步骤一，圆叶海棠组培苗在扩繁培养基中培养一个月，将茎基部的愈伤用手术刀切下，然后将再生的茎段移植到继代培养基中；

步骤二，再生的茎段在扩繁培养基中培养一个月，取完全伸展的功能叶横切中脉两至三刀，农杆菌侵染后转接到预分化培养基中，培养2-4天后转移到分化培养基中暗培养2周后光下培养，直至长出抗性芽，期间可以更换培养基；

步骤三，将抗性芽移植到继代培养基中进一步培养20-30天；

步骤四，挑选株高达到1.5cm的再生植株移植到生根培养基，培养一个月作用进行移栽。

进一步，所述步骤一和步骤三光下培养的条件光照16h/d、光照2000lux，温度为25℃，平均湿度为70–80％。

进一步，所述继代培养基为MS培养基，由IBA 0.1mg/L，6-BA 0.6mg/L，琼脂8g/L和蔗糖30g/L组成，pH为5.8。

进一步，所述预分化培养基由MS培养基、2.0mg/L N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.2mg/L吲哚丁酸、琼脂8g/L和蔗糖30g/L组成，pH为5.8。

进一步，所述分化培养基为MS培养基，由2.0mg/L N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.2mg/L吲哚丁酸、200mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素、琼脂8g/L和蔗糖30g/L组成，pH为5.8。

进一步，所述生根培养基为1/2MS培养基，由IBA0.9mg/L组成，pH为5.8。