[发明专利]一种氧化酶及其应用

说明书

本发明涉及一种来源于分散泛菌(Pantoea dispersa)的D‑乳酸氧化酶基因的获得及其克隆表达，属于生物工程领域。公开了其底物特异性，同时该D‑乳酸氧化酶可以氧化(R)‑α‑羟酸酯，可应用于光学纯(S)‑α‑羟酸酯的制备。

技术领域

本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。

背景技术

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)

目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N, Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis: evidence for abranched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998, 168(1):91-97)

本发明首次从分散泛菌(Pantoea dispersa)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。

发明内容

本发明从分散泛菌(Pantoea dispersa)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的 D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。

本发明的技术方案如下：

1、菌株

本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Pantoea dispersa ATCC 14593，购自美国ATCC菌种库。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Pantoea dispersa ATCC 14593菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。

3、D-乳酸氧化酶表达与纯化

将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。

4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析

以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。

酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from aStrain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry andBiotechnology,56, 1996,278-288。所述方法进行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯