[发明专利]哈蟆油药材DNA条形码鉴定PCR扩增引物及扩增方法

说明书

本发明公开了一种用于哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物，该引物对的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了一种获得哈蟆油药材DNA条形码的扩增方法，采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：94℃变性1分钟；94℃变性1分钟，50℃‑54℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。采用本发明的PCR扩增引物及扩增方法，其PCR扩增特异性强，能快速有效的获得哈蟆油药材DNA条形码，使利用DNA条形码技术进行哈蟆油药材及基原动物鉴定成为可能。

技术领域

本发明涉及中药基原物种鉴定技术领域，具体涉及一种哈蟆油药材及其基原动物鉴定的PCR扩增引物及扩增方法。

背景技术

中药鉴定是研究中药品种、质量，制定中药标准，寻找和扩大药源的前提和基础。中药四大传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法主要依据性状特征差异进行鉴定，这些性状特征是与物种的不同发育阶段和环境紧密相关的表现型，易受环境饰变和知识经验影响。而基因组DNA序列由物种的遗传基础决定，也是不同生物的不可变“身份证”，这为动植物分类和鉴定提供了本质依据。

DNA条形码(DNA barcoding)技术是通过PCR技术扩增基因组序列中一段通用DNA片段，对PCR扩增的通用DNA片段进行比较分析完成物种快速、准确的识别和鉴定。当前中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已经纳入2010版、2015版中国药典，该指导原则规定动物类中药材采用细胞色素C氧化酶亚基(COI)为主体序列，利用PCR通用引物(LCO1490和HCO2198)进行扩增反应，将扩增序列测序后进行数据库比对，从而确定动物药材基原物种。

但是，现在的通用引物及鉴定方法在哈蟆油药材鉴定中的使用效果并不好，非特异扩增较多，无法进行测序。因此，本领域技术人员想要开发一种哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物及扩增方法。

发明内容

为了解决COI通用引物在哈蟆油药材DNA条形码鉴定中存在非特异扩增的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种哈蟆油药材DNA条形码鉴定的PCR扩增引物及扩增方法。

本发明的一个方面提供了一种哈蟆油药材DNA条形码鉴定的扩增引物。在一个具体实施方式中，该扩增引物对的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ IDNo.2所示。

本发明的另一个方面还提供了一种获得哈蟆油药材DNA条形码的扩增方法。在本发明的一个具体实施方式中，该扩增方法采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物进行PCR扩增。

进一步地，上述PCR扩增的退火温度为50℃-54℃。

进一步地，上述PCR扩增的条件为：94℃变性1分钟；94℃变性1分钟，50℃-54℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。

优选地，上述PCR扩增的退火温度为54℃。

本发明的优势在于，使用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的扩增引物，并结合50℃-54℃退火的PCR反应条件，尤其是54℃的退火温度，能够对样品DNA进行特异性的扩增，从DNA电泳结果可以得到单一扩增条带。基于上述引物及扩增方法，能快速有效的获得哈蟆油药材DNA条形码，使利用DNA条形码技术进行哈蟆油药材基原动物鉴定成为可能。

附图说明