[发明专利]一种疟原虫pf/pan检测试纸的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物应用技术领域，特别是涉及一种疟原虫pf/pan检测试纸的制备方法。

背景技术

疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病，其居全球致死的寄生虫病的第一位。寄生于人体的疟原虫共有四种，即间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫。在我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫，其他两种少见，近年偶见国外输入的一些病例。不同的疟原虫分别引起间日疟、三日疟、恶性疟及卵圆疟。疟疾主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。

据法国国家科研中心介绍，每年全世界约有100万人死于疟疾，但医学界至今仍未研制出针对这种传染病的有效疫苗。作为疟原虫的一种，恶性疟原虫致病性极强，它主要存在于非洲、南美和亚洲的热带地区，并与80%的人类疟疾相关。十几年来，医学界一直使用青蒿素及其衍生产品对病人进行治疗，它不但治愈率高，而且见效很快。但是目前科学家们发现少数恶性疟原虫对青蒿素类药物表现出抗药性，这为疟疾的防治工作敲响了警钟。

目前国内外对于疟疾的主要检测方法有：镜检法、聚合酶链反应（PCR）、免疫学法。实验室诊断包括疟疾病原学诊断技术和疟疾抗体诊断技术，这些诊断技术中某些方法存在有检测上的缺陷。疟疾病原学诊断技术中的病原学诊断（显微镜血片检查）镜检法费时费力，而且需要专业人员操作，在疟原虫血症较低的时候容易出现误诊和漏诊。疟疾病原学诊断技术中的病原基因检测（PCR）检测需要专业的实验仪器和人员。疟疾抗体诊断技术 （IFA）需要荧光显微镜，荧光结果判定存在一定主观因素。疟疾病原学诊断技术中的病原免疫学诊断（快速免疫诊断试条）快速免疫诊断试条与显微镜检查疟原虫方法相似，主要用于疟疾病人的临床实验室诊断及居民带虫调查，具有方便、快速、简单、不需要仪器设备和有经验的检验人员等优点。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种疟原虫pf/pan检测试纸的制备方法，该制备方法得到的试纸采用一份微量样本（5微升）不仅可以检测是否感染了恶性疟，还可以检测除恶性疟以外的是否有其他三种疟疾（三日疟、卵形疟、间日疟）的单项或者混合感染，诊断快速且结果准确。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种疟原虫pf/pan检测试纸的制备方法，包括步骤为：

（1）制备pf重悬液：所述pf重悬液中包括三羟甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和吐温20，将三羟甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和吐温20溶于水并定容，调节pH值至8-9得到；制备pan重悬液：所述pan重悬液中包括三羟甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和酪蛋白，将三羟甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和酪蛋白溶于水并定容，调节pH值至8-9得到；制备包被基液：海藻糖溶于pH值为7-8的磷酸缓冲溶液并定容得到；

（2）将胶体金与碳酸钾混合并调节pH值，再加入恶性疟原虫乳酸脱氢酶（pfLDH）单克隆抗体、牛血清白蛋白溶液混合，离心得到第一沉淀，所述第一沉淀用所述pf重悬液重悬，得到pf免疫金；将胶体金与碳酸钾混合并调节pH值，再加入疟原虫乳酸脱氢酶（panLDH）单克隆抗体、牛血清白蛋白溶液混合，离心得到第二沉淀，所述第二沉淀用所述pan重悬液重悬，得到pan免疫金；

（3）用所述包被基液稀释所述恶性疟原虫乳酸脱氢酶（pfLDH）单克隆抗体得到恶性疟原虫乳酸脱氢酶（pfLDH）单克隆抗体检测线包被液；用所述包被基液稀释所述疟原虫乳酸脱氢酶（panLDH）单克隆抗体得到疟原虫乳酸脱氢酶（panLDH）单克隆抗体检测线包被液；用所述包被基液稀释羊抗鼠IgG多抗得到对照线包被液；

（4）用所述pf免疫金对金垫喷金得到pf免疫金垫；用所述pan免疫金对金垫喷金得到pan免疫金垫；用所述恶性疟原虫乳酸脱氢酶（pfLDH）单克隆抗体检测线包被液、所述疟原虫乳酸脱氢酶（panLDH）单克隆抗体检测线包被液和所述对照线包被液分别在贴于聚氯乙烯底板的硝酸纤维素膜上划线，得到点膜的聚氯乙烯底板；

（5）将样品垫、所述pf免疫金垫、所述pan免疫金垫、所述点膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装在一起，切割成疟原虫pf/pan检测试纸。