[发明专利]一种检测硝基还原酶的荧光探针

说明书

本发明公开了一种可以检测硝基还原酶的聚集诱导发光(AIE)型荧光探针，所述荧光探针命名为[2‑(4‑硝基苯基)‑1,1,2‑三苯基]乙烯，简称TPE‑NO₂。其化学结构式如(I)所示，本发明提供法人硝基还原酶荧光探针对细胞中的硝基还原酶有响应，本发明的探针可以通过荧光成像对肿瘤细胞乏氧状态下的硝基还原酶进行检测。。

技术领域

本发明涉及一种检测硝基还原酶 (NTR) 的荧光探针，属于有机小分子荧光探针技术领域。

背景技术

乏氧即供氧量不足，是很多疾病的重要特征，比如急性心肌梗死、炎症性疾病以及肿瘤疾病。目前，乏氧状态在临床上已经被作为肿瘤恶化的一种指标，因为恶性肿瘤在生长过程中，其对氧的需求量会增加，而肿瘤组织内的血液供氧不足，最终导致这部分肿瘤组织缺氧，在临床上大部分恶性肿瘤在生长过程中存在缺氧区。这些乏氧细胞不仅减弱了放疗、化疗的疗效，同时也成为了肿瘤复发的根源。因此，评估肿瘤内的缺氧程度在预测癌症治疗的效果和相关研究中至关重要。

检测肿瘤区域缺氧的方法有：血流速度、氧压力测量、缺氧标记法等，但这些检测方法在操作过于繁琐。因此，发展一种简单快捷、灵敏、高效的测试方法尤为重要。荧光探针具有广泛性、高灵敏性和专一性等优点，因而受到广泛关注。研究证明，缺氧环境会导致生物体内硝基还原酶的含量及活性增加。因此，通过检测硝基还原酶含量可以评价肿瘤区域的缺氧程度。

目前，国内外报道了许多检测硝基还原酶的荧光探针，但是这些荧光探针往往在稀溶液状态时具有较强的荧光信号，而在聚集状态或者浓溶液的状态下荧光强度会较小甚至完全淬灭，这就是所说的分子聚集诱导荧光淬灭现象(Aggregation-caused quenching，ACQ)，目前基于分子聚集诱导发光机制的硝基还原酶荧光探针还未曾有人报道。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明设计了一种检测硝基还原酶的聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission，AIE) 型荧光探针，在生物体内聚集，并且在与硝基还原酶作用前后荧光信号发生显著变化。本发明所报道的AIE型硝基还原酶荧光探针在生物活体检测中显示出很大的优越性，本发明的AIE型荧光探针，通过荧光成像技术检测硝基还原酶可用于评价肿瘤区域缺氧程度。

本发明所述的AIE型硝基还原酶荧光探针，命名为[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯，简称TPE-NO₂，其化学结构式如式（I）所示：

TPE-NO₂的制备反应式如下：

上述检测缺氧区硝基还原酶的AIE型荧光探针 (TPE-NO₂) 制备方法如下：将0.01mmol锌粉加入到80 mL重蒸的四氢呋喃溶液中，0℃，氮气保护下搅拌10分钟，缓慢滴加0.055 mmol四氯化钛到上述溶液中，加热回流2小时后，再向其中缓慢滴加0.03 mmol二苯甲酮 (A) 的四氢呋喃 (20 mL) 溶液，继续加热回流12小时。反应结束后加入100 mL 5 %氯化铵水溶液淬灭反应，使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂，经过乙醇重结晶后得到灰白色固体粉末1,1,2,2-四苯乙烯 B；将1,1,2,2-四苯乙烯 (B) 10 mmol溶于25 mL二氯甲烷中，0℃下，缓慢加入0.72 mL 浓硝酸和1 mL冰乙酸，0℃下搅拌30分钟后置于室温搅拌6小时，反应结束后加入水，抽滤，水洗至中性，粗产物经过柱层析提纯 (淋洗剂为石油醚：乙酸乙酯=50:1)，得到产物[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯C。

识别机理如下：