[发明专利]一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法

权利要求书

1.一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建包含ins启动子和指示钙离子浓度的荧光蛋白编码序列的PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒；

S2.转基因斑马鱼的创建；

S3.转基因斑马鱼的鉴定；

斑马鱼BAC_CH211_69I14包含基因ins的全部序列，斑马鱼BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列，荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中，可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化；

所述荧光蛋白序列为红色荧光蛋白Rcamp1.07，所述红色荧光蛋白Rcamp1.07是一种特异性指示钙离子浓度的蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法，其特征在于，利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为Rcamp1.07的序列。

3.根据权利要求1所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法，其特征在于，所述的获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建包含ins启动子和指示钙离子浓度的荧光蛋白编码序列的质粒，包括以下步骤：

S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列；

S2.把红色荧光蛋白Rcamp1.07蛋白编码序列克隆到R6K中间载体上；

S3.设计分别包含ins蛋白编码序列起始ATG上游同源序列和下游同源序列的引物对，PCR扩增Rcam1.07-frt-kana-frt序列，然后转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC_ins的大肠杆菌中，利用卡那霉素筛选Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins载体ins启动子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt；

S4.设计分别包含ins基因最上游同源序列和最下游同源序列的引物对，扩增两端携带I-SceI酶切位点的PNPC2载体片段，该PNPC2载体片段包含诺尔丝菌素抗性基因cloNAT，转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大肠杆菌中，利用诺尔丝菌素筛选出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重组质粒的大肠杆菌克隆；

S5.转染表达flpe的质粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中，催化两个frt序列的同源重组，去掉卡那霉素抗性基因，最终得到含有质粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大肠杆菌克隆。

4.根据权利要求3所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法，其特征在于，所述步骤S3的引物对为：

L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’；

R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’。

5.根据权利要求3所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法，其特征在于，所述步骤S4的引物对为：

L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’；

R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’。