[发明专利]微米颗粒在低温冻存中的应用

说明书

本发明发现微米颗粒具有良好的抑制冰晶生长的效果，可以抑制冷冻降温和复苏升温过程中冰晶的生长，保护细胞免受冰晶生长带来的机械损伤，提高细胞冷冻复苏存活率。在此基础上，本发明提供了微米颗粒在细胞低温冻存中的应用，微米颗粒在制备细胞低温冻存保护剂或保护液中的应用，以及利用微米颗粒进行细胞低温冻存的方法。

技术领域

本发明涉及微米颗粒在低温冻存中的应用，尤其是在细胞的低温冻存保护中的应用，属于生物化学材料领域。

背景技术

随着社会发展，再生医学和器官移植等技术引起了医学领域的高度重视，并且逐渐实现了对许多病症的治疗。因此在医学领域，对于不同配型的细胞、组织和器官的需求越来越迫切。例如，在英国，每天需要6000单位的血液，但血液只能在没有冷冻保存的情况下有效储存42天，而且在简单的细胞等渗液中具有很大的溶血速率。尽管越来越多的细胞、组织和器官被捐献以及组织工程产品被商业化，但是仍然有许多患者因为无合适的配体而失去救治的机会，另一面则是许多被捐献的细胞、组织和器官因为无法找到合适的受体而损坏。在美国，器官移植的等待名单目前超过118,000人(2013年5月)，而在2012年进行的移植手术少于30,000个。在此大环境下，必须要求没有器官被浪费，由此迫切地要求相关领域的工作者寻求出能长期有效的保存细胞、组织和器官的方法，以便在患者需要的时候能及时供给。

低温冻存细胞、组织和器官方法是传统但有效的保存方法，不过在低温冻存过程中，冰的形成和生长不仅会导致细胞的机械损伤，还会因液体水体积分数减少，细胞外溶质浓度的升高而导致渗透性休克。自然界为防冰材料的研究提供了很好的范本。例如，寒冷地区的昆虫，极地地区的鱼类在很低的温度环境下也能生存。1969年，斯坦福大学的DeVries在生活于南极的一种冷水鱼的血液中首次发现了抗冻蛋白。在此之后，科学家们又先后在极地鱼类、昆虫、植物等体内发现了多种抗冻蛋白。抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一类能够抑制冰晶生长的蛋白质，它能以非依数性的形式降低水的冰点而对其熔点影响甚微，导致水的熔点和冰点之间出现差值，称为热滞后活性。按摩尔浓度比较，抗冻蛋白降低冰点的效率是依数性盐类的200～500倍，这说明其降低冰点的机理与依数性盐类不同。当抗冻蛋白溶于水中时，抗冻蛋白分子可以选择性地吸附到冰晶的某些晶面上，从而改变冰的生长习性，引起冰晶形态的改变，致使冰晶的生长速率与纯水相比发生明显改变。但是抗冻蛋白在低温冻存中的应用存在两个问题：一、抗冻蛋白只能从生物体内分离得到，且产量非常低；二、实际使用抗冻蛋白低温冻存细胞的效果比预想的差很多，有时甚至降低细胞的存活率，研究发现这主要是由其热滞后活性的特性导致的。

尽管抗冻蛋白在低温冻存中的应用受限，许多研究者通过模拟抗冻蛋白抑制冰晶生长的特性，合成了许多高分子或糖蛋白来抑制冰的重结晶，进而实现这些新材料在低温冻存领域的应用。例如，Matthew I.Gibson通过合成的聚乙烯醇(PVA)有效的抑制冰的重结晶，并且在细胞低温冻存液中加入PVA时，能大幅度提高细胞存活率。但从实际应用的角度出发，高分子添加到细胞保存液中，形成稳定的溶液状态，很难将其从该体系中分离出来。此外，某些纳米颗粒诸如氧化石墨烯、氧化锆等由于其可与冰的某个晶面产生特异性吸附，也能实现抑制冰的重结晶过程。但是，纳米颗粒由于尺寸小而能够进入到细胞甚至细胞核中，其对细胞的毒性是未知的。此外，纳米颗粒容易聚集的现象也一直限制其在细胞低温冻存中的应用。因此，合成的高分子材料和纳米颗粒，其生物相容性以及被机体代谢的能力成为限制其应用的主要问题。

本领域中仍然需要开发出能有效抑制冰的重结晶，用于细胞等生物材料低温冻存时可提高细胞存活率，并具有低的细胞毒性，且易于从冻存体系中去除的材料。

发明内容

为了解决目前细胞低温冻存保护剂存在的生物毒性，难从低温保护体系中分离，不能重复利用，或者制备困难等问题，本发明的发明人通过科学研究，发现微米颗粒具有良好的抑制冰晶生长的效果，可以抑制冷冻降温和复苏升温过程中冰晶的生长，从而保护细胞免受冰晶生长带来的机械损伤，提高细胞冷冻复苏存活率。