[发明专利]一种增强zwf基因启动子表达强度的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过添加甜菜碱增强6‑磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf启动子表达强度的方法。通过该方法提高G6PDH的活力，具有成本低，且简便易行的特点，在添加量1g/L的条件下，即可达到zwf启动子表达强度增强0.98倍的效果；并且可以将其应用于氨基酸等发酵产品中，以及其它需要增强表达强度的基因，为以后氨基酸等发酵产品菌株的育种提供参考。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过添加甜菜碱增强6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf启动子表达强度的方法。

背景技术：

启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，就像“开关”，决定基因的活动。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。启动子位于结构基因5'端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。

目前常用的启动子类型有组成型启动子(能够使基因在所有细胞中都能启动表达的启动子)和诱导型启动子(在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平)。组成型启动子的调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性；而诱导型启动子可以通过外界的物理化学信号人为的调控结构基因的表达。

现有技术中的组成型启动子，表达强度不具有时空特异性，不可以人为的调控，在实际应用中不具备可操作性；而诱导型启动子中添加IPTG、乳糖等外源物质，其成本较高，并且对菌体本身有一定的副作用；温度诱导启动子则对温度较为敏感，对设备要求较高，增加能源的消耗。

如专利CN101148679A公开了一种同时受外源IPTG和O₂浓度调控的表达载体，该发明可以用于利用类球红细菌研究光合细菌中各种光合系统基因的表达以及在类球红细菌表达系统中人为调控外源蛋白的表达和纯化提供了有效的工具；专利CN102978232A、CN101914603A和CN104357423A分别公开了一种利用IPTG、乳糖或D-乳糖醇实现重组蛋白高效诱导表达的方法；专利CN102952817A提供了一种采用温度诱导生产外源蛋白的方法，通过控制外界温度实现对结构基因表达的调控；专利CN102978209A提供了一种可以在大肠杆菌中表达目的蛋白的组成型启动子。

本发明的目的在于改进现有的启动子调控技术，提供一种通过外源添加甜菜碱来增强zwf启动子表达强度的方法。可以将其应用于氨基酸等发酵产品中，以及其它需要增强表达强度的基因。本发明可以为以后氨基酸等发酵产品菌株的育种提供参考。

随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因。现有的报告基因主要有：分泌型胎盘磷酸酯酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖苷酸酶(GUS)、萤火虫荧光素酶(LUC)等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。最近，一种全新的非酶性报告基因—绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)引起了人们的关注，该蛋白能够通过翻译后自催化环化产生荧光。作为报告基因，GFP是目前唯一能在活细胞中表达的发光蛋白而且除了氧分子外不需要其他任何底物或辅因子；作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，因而被广泛应用于生命研究领域。本发明采用GFP作为报告基因，用以快速验证启动子的表达强度。

大肠杆菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH,编码基因为zwf)是磷酸戊糖途径(PPP)途径中的关键酶，而PPP是合成还原力NADPH的主要途径，很多氨基酸的合成都依赖于NADPH，通过提高zwf基因启动子的强度加强G6PDH的活力从而增加PPP途径的代谢通量来供应NADPH是提高氨基酸合成的一种途径。