[发明专利]一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L‑苏氨酸的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L‑苏氨酸的方法。所述基因工程菌是将出发菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的启动子P_ppc替换为6‑磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf)的启动子P_zwf，从而达到能通过甜菜碱调节其L‑苏氨酸生产能力的目的。在发酵过程中通过添加甜菜碱，可以使摇瓶发酵L‑苏氨酸产量达到50‑55g/L；5L发酵罐产量达到120‑150g/L，糖酸转化率达到59‑61％。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L-苏氨酸的方法。

背景技术：

启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动，但启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。启动子位于结构基因5'端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。

目前常用的启动子类型有组成型启动子(能够使基因在所有细胞中都能启动表达的启动子)和诱导型启动子(在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平)。组成型启动子不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性；而诱导型启动子可以通过外界的物理化学信号人为地调控结构基因的表达。

现有技术中的组成型启动子，表达强度不具有时空特异性，不可以人为地调控；而诱导型启动子需要添加IPTG、乳糖等外源物质，其成本较高，诱导剂有时候对菌体生长还有一定的副作用；温度诱导启动子则对温度较为敏感，对设备温度控制要求较高，而且温度的改变有时候也会影响细胞的正常代谢。

大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由ppc基因编码，催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)和CO₂反应生成草酰乙酸(Oxaloacetate，OAA)。反应方程式如下：PEP+CO₂＝OAA+Pi。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性增强，有助于增加草酰乙酸的积累，从而增加天冬氨酸的积累。天冬氨酸是L-苏氨酸合成的直接前体物，因此磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是L-苏氨酸合成的一个关键酶。另一方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反应能固定一分子CO₂，增强细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性，将增强细胞的CO₂固定反应，从而提高细胞代谢产物生产的糖酸转化率。反之，磷酸烯醇式丙酮酸将生成丙酮酸，转化为乙酰辅酶A后进入TCA循环。TCA循环虽然有利于细胞生成ATP，但同时生成两分子的CO₂。因此过多的TCA循环将导致细胞较低的糖酸转化率。对L-苏氨酸发酵生产而言，增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达是提高L-苏氨酸产量和糖酸转化率的有效方法。但是也有研究表明，过强的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶表达会影响细胞的正常代谢和生长，进而影响L-苏氨酸的合成和积累。因此，调节细胞不同时期的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性，调整CO₂固定反应和TCA循环的代谢流量对于L-苏氨酸发酵至关重要。

申请人在研究过程中发现甜菜碱能够有效地提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf)的启动子P_zwf的表达强度，且启动子P_zwf的表达强度随着甜菜碱浓度的增加逐步增强。因此本发明尝试将大肠杆菌染色体上的P_ppc替换为P_zwf，并采取发酵过程中流加甜菜碱的方式以调节磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达强度。随着发酵时间的延伸，甜菜碱的浓度逐渐提高，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达强度也随之增强。采用这种调控方式，在不影响细胞正常生长的前提下，实现对大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸的调控，达到提高L-苏氨酸产量和糖酸转化率的目的。

发明内容：