[发明专利]甲氧异黄酮的生物转化制备方法与用途

说明书

技术领域

本发明有关于一种利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，尤其指利用带有链霉菌(Streptomyces peucetius)SpOMT2884基因序列的环状重组质粒的微生物宿主，于含有8-羟基大豆苷元(8-hydroxydaidzein)的培养基培养一段时间后，以产生甲氧异黄酮的方法，且此甲氧异黄酮具有抑制黑色素形成的效果。

背景技术

异黄酮(isoflavones)主要存在于植物中，其中以大豆类的含量较高，故又称其为大豆异黄酮；存在大豆中的两种主要异黄酮为大豆苷元(daidzein)与金雀异黄素(genistein)。大豆异黄酮功效广泛，包含抑制细胞增生、抑制醛糖还原酶、抑制酪氨酸酶、抗突变、抗黑色素生成、增进癌症化学治疗效果等等。大豆异黄酮经微生物发酵后的衍生物，如甲基化(methylation)的甲氧异黄酮(methyl-isoflavones)，其稳定性、生物活性以及细胞膜通透性与生物利用性皆优于无甲基化的大豆异黄酮许多；曾有研究指出，4’-甲氧大豆苷元(4’-methoxydaidzein，又名formononetin)的抗黑色素生成活性，比大豆苷元高出10倍。

O-甲基转移酶(O-methyltransferase,OMT)是催化甲氧异黄酮产生的重要酶，其作用为将甲基基团(methyl group)，取代底物(substrate)羟基基团(hydroxyl group,-OH group)的氢原子(H)，使之成为甲氧基团(methoxy group,-OCH₃group)。O-甲基转移酶广泛存在于自然界中，目前已知植物或是微生物皆能表现此类酶。

由于甲氧异黄酮在自然界的产量十分稀少，已有研究利用生物转化的方式来制备甲氧异黄酮；例如美国专利US7432425B2将源自植物的7-O-甲基转移酶(7-OMT)基因，转殖入紫花苜蓿(alfafa)中，此基因转殖植物便能将大豆苷元(daidzein)转换成4’-O-甲基化异黄酮(4’-O-methlated-isoflavonoid)。然而，源自植物的O-甲基转移酶的底物特异(substrate specificity)性较高，单一种O-甲基转移酶能转化的底物种类较少，而源自微生物的O-甲基转移酶的底物特异性较低，一种O-甲基转移酶能转化较多种类底物，因此有研究者利用源自微生物的O-甲基转移酶进行试验，利用链霉菌(Streptomyces peucetius)SpOMT2884基因，转殖到微生物载体中转化7,8-二羟基黄酮(7,8-dihydroxyflavone)，藉此产生具有抗氧化能力的7-羟基-8-甲氧黄酮(7-hydroxyl-8-methoxyflavone)(Journal of Biotechnology,2014,volume 184,page128-137)。

由于黄酮或异黄酮种类繁多，各自具备的功能亦不相同，因此，若能利用生物转换方法，转换出更多具有不同生物功能的甲氧异黄酮，将有助于增进大豆异黄酮应用于美妆、保健或医药组合物的广泛性。

发明内容

发明人本着孜孜不倦的精神，并通过其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐，而据此研发出本发明。

本发明主要目的为提供一种利用生物转化制备甲氧异黄酮(Methoxy-isoflavones)的方法，其主要将8-羟基大豆苷元，以链霉菌(Streptomyces peucetius)的O-甲基转移酶SpOMT2884，转化后制得甲氧化的8-羟基大豆苷元(甲氧异黄酮)，且制备的产物具有抗黑色素生成的功效。

为了达到上述实施目的，本发明提供一种生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其包含下列步骤：

步骤一：合成具有编码(encoding)链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列、第一限制酶序列与第二限制酶序列的核酸序列，其中第一限制酶序列与第二限制酶序列分别位于编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列的上下游；

步骤二：将所述编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列以第一限制酶与第二限制酶切割；

步骤三：将表达质粒以第一限制酶与第二限制酶切割，并与步骤(2)切割后的核酸序列接合以形成环状重组质粒；

步骤四：将环状重组质粒置于适合的微生物表达系统中，并以含有8-羟基大豆苷元的培养基培养微生物表达系统，以产生甲氧异黄酮。

于本发明的一实施例中，链霉菌SpOMT2884蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。