[发明专利]一种蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒在审

专利信息
申请号: 201710014909.6 申请日: 2017-01-09
公开(公告)号: CN108285918A 公开(公告)日: 2018-07-17
发明(设计)人: 蔡启良;干劲;朱彩霞 申请(专利权)人: 复旦大学
主分类号: C12Q1/37 分类号: C12Q1/37;C12N9/50;C12N15/57
代理公司: 上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268 代理人: 吴桂琴
地址: 200433 *** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 快速检测试剂盒 体外SUMO化 原核表达 修饰 分子生物学领域 验证 大肠杆菌 反应缓冲液 生物化学 蛋白底物 底物蛋白 浓度配比 人源蛋白 蛋白体 试剂盒 种蛋 应用 蛋白 克隆
【说明书】:

发明属生物化学与分子生物学领域,涉及蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒,尤其涉及克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1,E2,E3以及SUMO‑1和SUMO‑2分子,以及应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。本发明中使用大肠杆菌原核表达并纯化SUMO化E1酶AOS‑Uba1,E2酶Ubc9,E3酶KAP1以及SUMO‑1和SUMO‑2分子,在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下,对特定的SUMO E3连接酶或是蛋白底物进行体外SUMO化修饰。该试剂盒可以方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有SUMO化修饰,能被广范围应用于SUMO化修饰验证实验。

技术领域

本发明属生物化学与分子生物学领域,涉及蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒,尤其涉及克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1,E2,E3以及SUMO-1和SUMO-2分子,以及应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。

背景技术

现有技术公开了小泛素相关修饰物(small ubiquitin-like modifier,SUMO)具有与泛素分子相近的分子量和相似修饰循环,被称为小分子泛素样修饰蛋白。研究显示,在哺乳类动物细胞中共有四类SUMO同种型(isoform),分别为SUMO-1,-2,-3和-4,其中,SUMO-1只能形成单SUMO修饰;SUMO-2和SUMO-3高度同源,序列一致性高达97%,可以形成多聚SUMO修饰,而SUMO-4具有组织特异性,且功能尚不清楚。有研究显示,SUMO分子经SENP酶切割活化后,依次经过E1激活酶,E2结合酶和E3连接酶作用,其C末端甘氨酸可与底物蛋白上的赖氨酸共价链接,从而实现SUMO化修饰,其中SUMO化E1激活酶由两个蛋白组成复合物共同协作;SUMO修饰主要存在于细胞核内,可影响酶活性,改变蛋白亚细胞定位,或是作为促进蛋白相互作用的信号,参与大型蛋白复合物的组装,最终广泛参与了基因转录的抑制与激活,DNA复制与修复,染色体重组与分离等过程;因此研究蛋白质的SUMO化具有重要的意义,而鉴定蛋白SUMO化修饰是SUMO相关研究中最重要的内容之一。

基于现有技术研究的现状,本申请的发明人拟提供一种蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒,进一步应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术研究的现状,提供蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒,尤其涉及克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1,E2,E3以及SUMO-1和SUMO-2分子,进一步应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证。

更具体的,本发明提供了蛋白体外SUMO化修饰快速检测试剂盒,其包括,克隆和原核表达SUMO化修饰系统的E1,E2,E3以及SUMO-1和SUMO-2分子。

本发明中的试剂盒应用于人源蛋白体外SUMO化修饰验证,其包括;

克隆人源SUMO化E1激活酶AOS1和Uba2基因,其中AOS1全长cDNA序列克隆至pET-28a原核表达载体,在其N端有用于纯化和检测His蛋白标签核酸序列;Uba2全长cDNA序列克隆至pET-11d;

本发明所述的编码蛋白为人源SUMO化E1蛋白酶AOS1和Uba2的氨基酸序列,所述序列AOS1蛋白的cDNA片段长为1038bp,编码346个氨基酸,分子量为38450Da的蛋白,序列如SEQID No:1所示的氨基酸序列;所述序列Uba2蛋白的cDNA片段长为1920bp,编码640个氨基酸,分子量为71224Da的蛋白,序列如SEQID No:2所示的氨基酸序列;所述的氨基酸序列,还包括SEQID No:1和SEQID No:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列;

本发明提供了一种核苷酸序列,该核酸序列编码上述的蛋白质;

本发明中,分别利用所述的AOS1和Uba2重组原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中成功表达出重组蛋白,两个蛋白在缓冲液中互作结合之后,利用His标签纯化AOS1-Uba2蛋白;

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