[发明专利]一种表达鲑鱼降钙素的方法及其专用表达盒

说明书

本发明公开了一种表达鲑鱼降钙素的方法及其专用表达盒。本发明所提供的方法依次包括如下步骤：(1)将重组载体导入受体植物，得到转基因植物；(2)通过培养所述转基因植物得到鲑鱼降钙素；所述重组载体含有表达盒；所述表达盒依次包括如下元件：植物油体蛋白基因的启动子、融合基因和终止序列；所述融合基因中含有区段甲和区段乙；所述区段甲编码植物油体蛋白；所述区段乙编码鲑鱼降钙素的前体；所述鲑鱼降钙素的前体为氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白质。实验证明，采用本发明提供的方法可以得到生物学活性较高的鲑鱼降钙素。因此，利用本发明所提供的方法表达鲑鱼降钙素，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达鲑鱼降钙素的方法及其专用表达盒。

背景技术

鲑鱼降钙素是由鲑鱼后腮体分泌的由32个氨基酸组成的单链多肽。鲑鱼降钙素作为治疗骨质疏松症等代谢性骨病的防治药已被载入多国药典，并已在多国行销近30年。鲑鱼降钙素具有调节体内钙、磷代谢及骨骼代谢的重要生物学功能，可降低血钙水平，还具有抗组胺、抗胆碱、抑制胃酸和胰腺分泌的作用。临床上主要用于治疗骨质疏松症。鲑鱼降钙素的生产方法主要有提取法、化学合成法和基因工程法。提取法是以鲑鱼、鳗鱼的鳃为原料，提取获得天然鲑鱼降钙素(生物学活性达到4500U/mg)，但由于原料有限，因此获得的天然鲑鱼降钙素极少。基因工程法是在大肠杆菌或酵母中表达鲑鱼降钙素，但由于鲑鱼降钙素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表达出的鲑鱼降钙素的生物学活性，仅为100-200U/mg(天然鲑鱼降钙素为4500U/mg)。迄今为止，商业化销售的鲑鱼降钙素都是采用化学合成法生产的，化学合成法步骤多、得率低且价格昂贵，注射针剂中的鲑鱼降钙素为12000元/mg，原药价格也高达18000-20000元/g。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何表达鲑鱼降钙素。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了表达盒。

本发明所提供的表达盒自上游至下游依次可包括如下元件：植物油体蛋白基因的启动子、融合基因和终止序列；

所述融合基因中可含有区段甲和区段乙；所述区段甲编码植物油体蛋白；所述区段乙编码鲑鱼降钙素的前体；所述鲑鱼降钙素的前体可为氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白质。

所述融合基因中，5’末端为起始密码子，3’末端为终止密码子，中间为连续的编码区。

所述鲑鱼降钙素的前体在植物体内可自发形成鲑鱼降钙素。

所述区段乙可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子。

所述融合基因还可包括一个以上区段丙；所述区段丙编码蛋白标签。所述蛋白标签具体可为6×His标签。

所述融合基因还可包括区段丁；所述区段丁可为蛋白酶的酶切识别序列。

所述蛋白酶可为满足如下条件的蛋白酶：所述蛋白酶对于所述融合基因的表达产物的酶切位置为特定氨基酸残基与其前一位氨基酸残基之间；所述特定氨基酸残基为所述鲑鱼降钙素的前体的第一个氨基酸残基。

所述蛋白酶具体可为肠激酶。