[发明专利]一种改造的热稳定无机焦磷酸酶

说明书

本发明公开了一种热稳定无机焦磷酸酶，其特征在于，所述焦磷酸酶是由序列为SEQ ID NO:1的无机焦磷酸酶改造而来，其改造方法为下述方法中的至少一种：1）将第6位氨基酸T改造为氨基酸S；2）将第11位氨基酸E改为氨基酸K；3）将第72位氨基酸L改为氨基酸I；4）将第73位氨基酸V改为氨基酸I；5）将第124位氨基酸D改造为氨基酸A；6）将第160位氨基酸A改造为Q或K。经过改造以后，获得的无机焦磷酸酶具有更高的扩增效率，热稳定性也更好。

技术领域

本发明涉及酶的改造，特别涉及一种热稳定无机焦磷酸酶的改造。

背景技术

在生物体内，NTPs/dNTPs参与核酸的生物合成会生成副产物焦磷酸盐，体内存在的焦磷酸盐会在焦磷酸酶的催化作用下分解，减少焦磷酸累积可能造成的负面效应。PCR利用嗜热酶模拟体内核酸复制的体外反应，伴随dNTPs的参入，焦磷酸的累积同样会降低PCR扩增的效率。

焦磷酸的积累，会导致反应混合物的pH降低，影响荧光染料的稳定性(罗氏，200510099911.5)。为了去除这些焦磷酸对PCR的抑制，人们在PCR反应中添加无机焦磷酸酶，用以将焦磷酸(PPi)会水解为正磷酸(Pi)。

这种反应，会使反应混合液的pH增加，并是的荧光染料变得更稳定。

为了适应PCR的高温，这种焦磷酸酶必须能耐受95℃的高温。

赵丹彤等人重组表达了超嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)的PPase基因(赵丹彤.重组超嗜热无机焦磷酸酶的表达、纯化及酶学性质研究[D].吉林大学,2003.)，这种酶最适温度为88℃，最适pH为10.3，并不适合PCR的使用。

牟航等人重组表达了嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)HB27株的PPase基因(牟航,夏勇,吴学强,等.耐热无机焦磷酸酶的表达纯化与性质研究[C]//全国酶学学术讨论会暨邹承鲁诞辰85周年纪念会.2008.)，王磊等人重组表达了嗜热栖热菌HB8株的PPase基因。这种酶的最适温度在65℃，最适pH为8.0，适合PCR的使用。然而这种酶的95℃下的半衰期仅20min，不足以满足预变性时间较长，以及循环数较多的PCR反应。

由此，基于嗜热栖热菌的PPase基因，构建一种改造的热稳定无机焦磷酸酶，这种酶可以应用于需要更多循环数以及反应时间的超敏PCR扩增，增加反应的扩增效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有更高扩增效率的热稳定无机焦磷酸酶。

本发明所采取的技术方案是：

一种热稳定无机焦磷酸酶，由序列为SEQ ID NO:1的无机焦磷酸酶改造而来，其改造方法为下述方法中的至少一种：

1)将第6位氨基酸T改造为氨基酸S；

2)将第11位氨基酸E改为氨基酸K；

3)将第72位氨基酸L改为氨基酸I；

4)将第73位氨基酸V改为氨基酸I；

5)将第124位氨基酸D改造为氨基酸A；

6)将第160位氨基酸A改造为Q或K。

一种热稳定无机焦磷酸酶，其序列为：