[发明专利]用于检测金针菇表面乳球菌的LAMP引物及检测方法

权利要求书

1.用于检测金针菇表面乳球菌的LAMP引物组，其特征在于所述的引物组由两个外引物，两个内引物和两个环引物组成；其中所述的两个外引物为：

F3：5’-TGTTTTTCAGACTCTACGTATG-3’（SEQ ID No.1），

B3：5’-ACGTGGTTATGGTACAACTT-3’（SEQ ID No.2）；

所述的两个内引物为：

FIP：5’-ACACGAATTCGCAACAATCCCT-GGCAATTCCTTTAACCGC-3’（SEQ ID No.3），

BIP：5’-TTGAATTGAAGTCACAGCAGCA-AGGTAACTCTCTGCGTCG-3’（SEQ ID No.4）；

所述的两个环引物为：

LF：5’-GCGTACGTGAAGATGTCATCCAAA-3’（SEQ ID No.5），

LB：5’-CCAGGAAGTGATGACAAAAGGA-3’（SEQ ID No.6）；

所述的金针菇表面乳球菌是指乳酸乳球菌霍氏亚种（Lactococcus lactis subsp.hordniae）菌株或乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）菌株。

2.用于检测金针菇表面乳球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的LAMP引物组。

3.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于还包括：链置换型DNA聚合酶、反应缓冲液，荧光试剂，去离子水；阴性对照模板，阳性对照模板。

4.根据权利要求3所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的反应缓冲液包括：pH为8.8的20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，0.1% Tween 20，0.8M 甜菜碱，8mMMgSO₄，1.4mM dNTPs；所述的阴性对照模板是指去离子水DW；所述的阳性对照模板是指PCDNA。

5.权利要求1所述的LAMP引物组在检测金针菇表面乳球菌上的应用；所述的金针菇表面乳球菌是指乳酸乳球菌霍氏亚种（Lactococcus lactis subsp. hordniae）或乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）。

6.权利要求2~4任一所述的LAMP检测试剂盒在检测金针菇表面乳球菌上的应用；所述的金针菇表面乳球菌是指乳酸乳球菌霍氏亚种（Lactococcus lactis subsp. hordniae）或乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）。

7.利用权利要求1所述的LAMP引物组检测金针菇表面乳球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取待测金针菇表面菌总DNA；

（2）配制反应液：LAMP反应体系25µl：2×RM 12.5µl，1.6µM内引物FIP和BIP各2µl，0.2µM外引物F3和B3各0.25µl，0.8µM环引物LF和LB各1µl，荧光试剂钙黄绿素 1µl，BstDNA聚合酶1µl，待测样品DNA 2µl，去离子水DW 2µl；阴性对照模板为去离子水DW 2µl，阳性对照模板为PC DNA 2µl；其中RM为：含pH为8.8的20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，0.1%Tween 20，0.8M 甜菜碱，8mM MgSO₄，1.4mM各dNTPs；

（3）在63℃下恒温反应1h，然后在85℃下5min结束反应；

（4）肉眼观察反应液颜色变化，如果反应液为橙色，说明没有乳球菌；如果反应液为绿色，说明存在乳球菌；或者在凝胶成像仪下观测，有荧光的，说明存在乳球菌；没有荧光的，说明没有乳球菌；

所述的乳球菌是指乳酸乳球菌霍氏亚种（Lactococcus lactis subsp. hordniae）或乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）。