[发明专利]可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用

权利要求书

1.可溶性单链抗体超抗原融合基因sumo-b-l-sag，其特征在于：序列为SEQ ID No:1中的碱基序列。

2.一种权利要求1所述基因编码的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAG，其特征在于：序列为SEQ ID No:2中的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述的可溶性单链抗体超抗原融合基因sumo-b-l-sag的制备方法，其特征在于：

人源性抗HER-2的单链抗体基因b和 SAG的编码基因sag通过编码连接短肽的DNALinker连接成b-l-sag基因，并将带有组氨酸标签的小泛素化修饰促融蛋白SUMO编码基因sumo使用Overlap PCR方法同b-l-sag的5‘端相连接，序列为SEQ ID No:1中碱基序列；

（1）所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为，

GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC；

（2）采用引物：

正向引物: 5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3 反向引物: 5’-AGCTGCACCTGGGCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3

通过PCR技术扩增出sumo基因片段

（3）采用引物：

正向引物:5’- ACAGAGAACAGATTGGT GCCCAGGTGCAGC -3 反向引物: 5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG -3 通过PCR技术扩增出b-l-sag基因片段

（4）采用引物：

正向引物: 5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3 反向引物: 5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG -3 通过Overlap PCR技术构建融合基因sumo-b-l-sag。

4.按照权利要求3的制备方法，其特征在于：单链抗体基因b序列为SEQ ID No:1中从第355位到1128位的碱基序列；SAG的编码基因sag序列为SEQ ID No:1中从第1171位到1887位的碱基序列；DNA Linker序列为SEQ ID No:1中从第1129位到1170位的碱基序列；b-l-sag基因序列为SEQ ID No:1中从第355位到1887位的碱基序列；小泛素化修饰促融蛋白SUMO编码基因sumo序列为SEQ ID No:1中从第1位到354位的碱基序列。

5.一种权利要求2所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAG的异源表达方法，其特征在于：利用原核表达载体；以大肠杆菌为宿主菌，异源表达融合蛋白SUMO-B-L-SAG，经过菌体超声波破碎，离心收集上清液， Ni亲合层析纯化、超滤脱盐后得到具有生物学活性的可溶性融合蛋白B-L-SAG。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：利用原核表达载体为pET-28a表达载体；宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3) 。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：采用Ni亲合层析柱对目的产物进行纯化，纯化时以0.2-0.8 ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲合层析柱；以含20-80mM 咪唑的平衡缓冲液洗涤8-12个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；以250-300 mM 咪唑的洗脱缓冲液洗脱，洗脱产物经超滤浓缩除盐。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的平衡缓冲液的组成为：20mM Tirs-HCl，500mM NaCl，20-80mM咪唑，溶液的pH值范围为：7.2～8.0；所述的洗脱缓冲液的组成为：20mM Tirs-HCl，500mM NaCl，250-300 mM咪唑，溶液的pH值范围为：7.2～8.0。

9.一种权利要求2所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白的应用，其特征在于：所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白可用于肿瘤治疗药物的开发。