[发明专利]杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体。

背景技术

甲萘威是一种氨基甲酸酯类光谱杀虫剂，对于害虫具有触杀、胃毒作用，在我国农业生产中广泛使用，在世界范围内农产品及食品的农药残留检测中检出率最高的农药之一。甲萘威对哺乳动物具有中等毒性，对小鼠的半致死剂量(LD50)为300mg/kg。欧盟化学品审查委员会已提出禁止使用甲萘威，认为其属于第三类致癌物质。主要残留在谷物、水果和蔬菜中，对消费者健康具有潜在的威胁。因此，加强对甲萘威的检测是保障农产品及食品安全的一个重要环节。

我国甲萘威在谷物中限量为0.5-1mg/kg，蔬菜中为1mg/kg，茶叶中为1mg/kg。目前用于甲萘威的检测方法主要采用基于色谱原理的紫外-高效液相色谱法、二极管矩阵-高效液相色谱法、荧光-高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)、质谱-高效液相色谱法等，这些方法灵敏度高、检测结果可靠。但是前处理和分析步骤复杂，需要专业的仪器，对操作人员专业性要求较高，检测成本高，耗时长。不适合现场大批量样品筛查检测。免疫分析方法克服了以上缺点，具有操作简单、成本低廉、不需专业仪器设备，适合现场筛查的特点。已经广泛应用于农产品检测领域。免疫分析以抗原抗体特异性结合反应为基础，通过标记物对抗体或抗原进行标记，将微量目标物信号放大，从而实现定量检测，抗体的灵敏度和特异性决定了所建立的免疫技术检测结果的准确度。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株Jnw1D2及其产生的抗甲萘威单克隆抗体。

本发明提供了杂交瘤细胞株Jnw1D2，该杂交瘤细胞株已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201654。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗甲萘威单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的抗甲萘威单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

本发明进一步提供了抗甲萘威单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO:C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该抗甲萘威单克隆抗体可以识别甲萘威，对甲萘威的50％抑制浓度IC50为0.668ng/mL。

上述抗甲萘威单克隆抗体在甲萘威含量测定中的应用。

杂交瘤细胞株Jnw1D2的具体筛选步骤如下：将BALB/c小鼠经甲萘威完全抗原CNH-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的完全抗原CNH-BSA做最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，然后采用ELISA方法分两步筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗甲萘威而不抗载体蛋白BSA的阳性孔，第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用甲萘威标准品作为竞争原，选择吸光值和抑制率均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株Jnw1D2。

本发明提供的抗甲萘威单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将上述获得的杂交瘤细胞株Jnw1D2注射到预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗甲萘威单克隆抗体。