[发明专利]羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物

说明书

本发明提供了一种羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物，该专用引物根据羊传染性脓疱病毒的B2L基因和绵羊肺炎支原体的P80基因序列，设计了两对可扩增B2L基因和P80基因的特异性引物。通过对引物浓度、退火温度等条件的优化，建立了快速检测羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR方法。电泳图中出现402bp的特异性片段为羊传染性脓疱病毒阳性；出现700bp的特异性片段为绵羊肺炎支原体阳性。本发明可实现同一反应体系中对羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体进行检测，具有快速、特异、准确诊断病原等优点，为生产中这两种病原感染的鉴别诊断和流行病学调查提供了新的方法。

技术领域

本发明涉及羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法，属于预防兽医学领域。

背景技术

羊传染性脓疱病（Contagious ecthyma, CE）俗称羊口疮（Orf），是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus, ORFV)感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人畜共患病。该病的发病率为4%-100%，死亡率为1%-59%。绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，Mo) 是引起绵羊和山羊支原体性肺炎的主要病原体之一，羊支原体性肺炎临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症, 发病率为20%-60%，病死率一般为30%～50%, 有的高达80%。Mo结构复杂、培养困难，目前仍缺乏有效的生前诊断和防治措施，给养羊业造成巨大经济损失。我国羊病的发生已日趋复杂，多重感染较为普遍，给羊病防治造成很大困难。

当前确诊羊支原体性肺炎的方法主要是病原分离鉴定, 但是支原体的体外培养成本较高, 培养条件要求苛刻,生长缓慢, 尤其是绵羊肺炎支原体很难培养，临床病例确诊一般需要2-3周时间, 显然不能满足快速诊断的需要。，而PCR方法简单、快速、准确，已成为实验室诊断常用方法。国内外一些学者应用PCR技术对羊传染性脓疱病和山羊传染性胸膜肺炎进行了诊断和流行病学研究, 国内的屈勇刚等、李媛等、储岳峰等分别建立了绵羊肺炎支原体PCR 检测方法及绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种二重PCR 检测方法,颜新敏等建立了快速鉴别诊断羊痘病毒和羊口疮病毒的双重PCR方法， 但目前国内外尚无同时快速检测羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体方法的报道。本发明提供快速、特异、灵敏的鉴别或同时检测羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体的双重PCR 专用引物和双重PCR检测方法, 适用于临床快速检测和流行病学调查，有广阔的应用前景，具有重大的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物及其检测方法，具体为一种快速、特异、准确诊断羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体专用引物及双重PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体专用引物设计；羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR检测方法的建立；从待检羊的鼻拭子或鼻、唇等结痂处提取组织DNA，然后将获得的DNA模板以及针对羊传染性脓疱病毒B2L基因和绵羊肺炎支原体P80基因设计合成的两对引物加入到同一个反应体系中进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；其中，PCR反应的专用引物序列分别为：

专用引物B2L 上游序列5’- AGGCGGGCGTCAACTACTACAA-3’，

专用引物B2L下游序列5’- TTCTTGGCGTTCTCGATGCGGT-3’。

用于扩增羊传染性脓疱病毒B2L基因，目的片段为402bp。

专用引物P80 上游序列5’-GCCTTGGGGTTGGAATTCCTTTGTCTTATTC-3’，