[发明专利]一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于动物医学领域中牛支原体病的检测，特别涉及一种用于检测牛支原体病原的实时荧光定量检测试剂盒及其专用引物、探针与其在检测牛支原体中的应用。

背景技术

牛支原体一种能引起犊牛肺炎，成年牛乳腺炎的重要的病原微生物。1961年，美国科学家hale首次从患有乳腺炎的牛乳中分离到了牛支原体。对牛支原体的研究越来越深入。牛支原体属于柔膜体纲，支原体目，支原体属，无乳支原体，牛支原体亚种。除了能引起上述的肺炎和乳腺炎以外。在患有耳炎，关节炎，结膜角膜炎，生殖道炎症及不孕不育症等的病牛样本中均曾分离到牛支原体。每年在欧美地区由牛支原体引起的奶牛乳腺炎，犊牛肺炎等症状对养牛业造成的损失巨大。随着优质的外国种牛引进国内，在我国的湖北，重庆，内蒙等地区相继爆发了由牛支原体引起的相关疾病。发病率高达50％，某些地区病死率更是达到了100％。然而，国内缺乏相关研究延误对本病的诊断及治疗。从而引发了本病的进一步扩大及传播。目前，对牛支原体的检测有三种方法，血清学诊断，病原学诊断。

牛支原体的病原学诊断是实验室中的最为常用的诊断方法。通过对病牛样品中的总DNA提取，目的基因的PCR扩增及凝胶电泳从而诊断病原微生物。该方法较传统的培养法而言，周期短，特异性强。然而牛支原体属于无乳支原体牛亚种，它的DNA序列与牛乳支原体的相似性达到了98％。这不仅影响牛支原体PCR诊断方法的建立，更是对牛支原体血清学诊断产生了巨大的障碍。由于牛支原体与无乳支原体大量的膜蛋白相似，导致血清学的诊断方法的特异性低。

探针法(Taqman)指的是水解寡核苷酸探针。这种方法使用了具有5’外切核酸酶活性的聚合酶。该探针在5’端标记报告荧光基团，在3’端标记淬灭基团，在探针完整时报告荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，因此没有荧光产生。在延伸阶段，由于DNA聚合具有5’-3’外切酶活性，5’端标记报告荧光基团被水解掉，远离淬灭基团，于是产生荧光信号。如果在过程中，底物序列不能同探针互补，则探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到。相反，如果正确的底物被扩增出来后，探针就会在复性阶段与其杂交，当聚合延伸到探针时，它就会将探针的5’端给替换下来，并将报告基团切割下来，这就使得报告基团和淬灭子分开，从而使荧光信号释放出来，可通过检测系统观察到信号的变化。Taqman探针的优点是可以利用多种荧光同时进行多重分析，这是等结合荧光基团所不具备的优点。

TU基因的功能是编码主要负责肽链延伸的延伸因子tuf。而肽链延伸是蛋白质合成的重要步骤。TU基因具有功能保守，其遗传稳定性及广泛分布性，使其成为遗传进化分子标靶重要基因。实验表明，Tuf基因比16sRNA基因更适合作为分子标靶。荧光定量PCR具有快速、稳定、灵敏等特点。在实验室及临床诊断，荧光定量PCR被广泛运用。该实验通过建立荧光定量Taqman探针法，为实验室及临床诊断提供依据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒及其使用方法，已解决现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒，包含TaqMan探针，PCR检测引物或该引物的衍生序列，PCR扩增试剂，阳性对照和阴性对照,

所述引物的衍生序列，是指在上述序列的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。其TaqMan探针是根据衍生序列、牛支原体目的基因序列自行设计合成，具有特异性、唯一性。

所述PCR扩增试剂为pfu DNA扩增酶、dNTPs和缓冲液，均为经经试验比较后的最佳配比浓度。

所述阳性对照为牛支原体标准株基因组或携带牛支原体基因的克隆质粒，优选为pMD19-T-TU；所述阴性对照为不含牛支原体基因的pMD19-T空载体质粒。

所述试剂盒包括实时荧光定量反应条件为94℃预变性3min，94℃变性10S，60℃退火30S，共40个循环。

所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒使用方法，包含以下步骤：

[1]待检样本PCR模板的制备方法：

(1)取支原体培养物、组织匀浆液或鼻腔拭子浸液100μL，按照DNA提取试剂盒提取总DNA备用；

[2]牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒反应体系组装：

(1)取酶混合物12.5μL，上下游引物引物各1μL,探针1μL；

(2)加入已制备好DNA模板2μL，用灭菌双蒸水补至25μL；

[3]PCR扩增参数为：