[发明专利]一种硬骨特异性钙质荧光染色方法及其应用

说明书

本发明属生物技术领域，涉及一种硬骨特异性钙质荧光染色方法及其应用，该方法采用天然提取物红紫素（purpurin）、光泽汀（lucidin）或3‑羟基巴戟醌（3‑hydroxy‑morindone）作为荧光染色剂，可在活体脊椎动物（如斑马鱼和小鼠）中对硬骨进行荧光标记。该方法操作简单快捷，可被用于活体动态观察，硬骨荧光染色观察清晰。本方法为检验临床样本中硬骨和增生骨组织提供新的染色方案和工具。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种硬骨特异性钙质荧光染色方法及其应用，尤其涉及一种可以特异性标记活体脊椎动物硬骨的荧光染色方法及其应用，该方法采用天然提取物红紫素（purpurin）、光泽汀（lucidin）或3-羟基巴戟醌（3-hydroxy-morindone）作为荧光染色剂，可在活体脊椎动物（如斑马鱼和小鼠）中对硬骨进行荧光标记。该方法可被用于活体动态观察。

背景技术

现有技术公开了红紫素（purpurin， CAS：81-54-9），又称1,2,4-三羟基蒽醌、尿红素、紫茜素、紫精，是茜草的天然成分，作为一种红/黄色染剂可用于棉布的快速染色。研究显示，红紫素可与多种金属离子形成复合物，可用于检测锆、硼、钙的试剂；此外，研究还显示，由于红紫素的分子六元（芳族的）环含有善于传递电子的羰基和羟基，富含电子，因此，很容易与锂离子结合，可作为原料制作红紫素电极生产新型的无毒持久的电池；

光泽汀（lucidin，CAS：478-08-0）同为蒽醌衍生物，也是一种茜草的天然成分，能诱导细菌和哺乳动物细胞的突变，同时具有抗菌、抗炎、抗癌等功能，其药用价值在于其根部包含的蒽醌类物质；有研究显示，天然的蒽醌类物质通常还具有良好的着色能力，被广泛用于食品、药品、化妆品、纺织品以及头发的染色；

3-羟基巴戟醌（3-hydroxy-morindone）是一种CAS号待定的新品小分子化合物，其作用尚未知。

目前通行的硬骨染色法为茜素红法钙质染色法（发表于1952年），此种染色方法的包括如下步骤：

1. 组织固定和/或切片：组织用10%甲醛或4%多聚甲醛固定，避免溶液含钙或有脱钙效果；小动物样本可直接继续染色，临床和厚组织可进行石蜡切片，并经脱蜡至水洗；

2. 染色：蒸馏水水洗5-10min，加入茜素红染液染色5-30min，再用蒸馏水速洗。茜素红染液配法如下：0.5g 茜素红粉末溶解于100ml蒸馏水中，使用Tris-HCL调节溶液PH至8.3。取10ul上述溶液加入40-60 mM MgCl2与70%乙醇混合液中即得到茜素红染液；

3. 漂白：用漂白液洗去样本表面色素和多余的染液。漂白液现配现用，由等量的3% H2O2和2%KOH混合组成，终浓度为1.5%H2O2和1%KOH溶液；

4. 清理或封片：对于小动物样本，去掉漂白液，加入20%甘油/0.25KOH室温振荡30min至10h，边振荡边观察胚胎清理状态，然后用50%甘油/0.25%KOH替换之前的清理液，并再次室温振荡2h，放置过夜，显微镜下观察；对于切片样本，用0.2%冰醋酸水溶液速洗，后用95%乙醇、无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明后中性树胶封固。

由此可见，传统的茜素红法钙质染色法步骤复杂，且耗时久，在染色开始前，需对标本进行固定，无法活体实时观察骨质的变化过程。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种硬骨特异性钙质荧光染色方法，尤其是可以特异性标记活体脊椎动物硬骨的荧光染色方法，该方法采用天然提取物红紫素（purpurin）、光泽汀（lucidin）或3-羟基巴戟醌（3-hydroxy-morindone）作为荧光染色剂，可在对小动物的硬骨进行活体染色，且方法简便易行，可明显观察到样本处理过程中的变化。

发明内容