[发明专利]NtRRS2基因及其在烟草抗青枯病中的应用

说明书

本发明公开了烟草CC‑NBS‑LRR类抗病基因NtRRS2及其在烟草抗青枯病中的应用，属于植物基因工程领域。本发明首先提供了从烟草抗青枯病品种岩烟97中克隆得到的NtRRS2基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明进一步将上述NtRRS2基因转入到烟草中进行功能验证。结果表明，超表达NtRRS2基因能显著增强感病品种对青枯菌的抗性。本发明分离的NtRRS2基因是调控烟草对青枯菌抗性的重要基因，可提高烟草对青枯病的抗性，在烟草抗青枯病分子育种等方面具有重要应用前景。

技术领域

本发明涉及NtRRS2基因及其在烟草抗青枯病中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物。烟草青枯病是烟草的重要病害之一，该病害属土传性细菌性病害，从根部或伤口侵入，导致植株枯萎死亡，在中国俗称“烟瘟”。该病分布较为广泛，主要分布于高温高湿的热带及亚热带地区。近年来表现出逐渐向高纬度、高海拔寒带地区扩展的趋势。该病害严重危害我国长江流域及南方的烟叶产区，给烟农造成巨大的损失，造成严重产量损失的有福建、广东、广西等多个省份的烟区。目前尚未有经济有效的防治烟草青枯病手段，而从根本上解决的有效途径是培育抗病品种，与传统育种方法相比，利用基因工程育种手段培育出优质高产的抗青枯病品种可更有效的解决烟草青枯病问题。

目前我国已开展了烟草基因组的测序工作，并完成了两个野生原始种的基因组测序，但栽培种的基因组序列尚在组装过程中。这将有利于烟草抗青枯病基因的克隆和鉴定，促进烟草抗青枯病分子育种。细菌性青枯病为害寄主范围很广，但除了拟南芥，尚未从正向遗传学手段获得抗青枯病基因。目前在拟南芥上获得的TIR-NB-LRR类抗青枯基因RRS1-R和LRR-RLK类抗青枯基因ERECTA。而NBS-LRR类抗性基因常包含核苷酸结合位点（NBS）和富亮氨酸重复（LRR）结构域。NBS的保守结构域包含了多个在植物信号转导过程中起关键作用的保守功能区，如P-Loop，Kinase-2，Kinase-3a和GLPL等。LRR结构域则介导病原相关分子模式引发的免疫反应（PTI）中。植物遭到病原菌入侵后，通常会在侵染部位通过产生过敏反应，来抵御病原菌的扩散和繁殖，进而激活下游一系列的相关防卫反应。植物的防御反应过程是复杂的信号转导调控网络作用的结果，该调控网络由抗性通道或SA，ET，JA等植物激素参与的信号转导通路交叉形成。目前烟草中NBS-LRR类抗青枯基因的报道甚少，烟草抗青枯的分子机理及其调控网络的研究甚少，这严重制约了烟草抗青枯病的分子育种进程。

本发明针对以上背景技术，研究基于实验室前期的烟草基因芯片数据分析结果，发现了一个经青枯菌诱导后在抗感品种上均上调表达的CC-NBS-LRR类抗性基因，命名为NtRRS2，作为抗青枯病关键候选基因。利用Race技术从烟草抗病品种岩烟97中克隆了该基因的全长序列，包含完整的开放阅读框，包含CC基序、NB-ARC和多个富亮氨酸基序（LRR-RI）保守结构域，符合CC-NBS-LRR类的抗病基因家族的特点。利用Gateway技术构建了超表达载体，酶切连接法构建了RNAi载体，分别转入感病品种红花大金元和抗病品种岩烟97中，进行遗传互补功能验证。对转基因烟草植株进行青枯菌接种鉴定，结果表明超量表达NtRRS2基因可显著增强烟草青枯病抗性，而RNAi沉默并未使植株完全感病，这说明该基因可能参与了抗病防御反应，但与岩烟97抗青枯病信号通道相关，可能是通过识别受体蛋白而激活下游抗性信号通道。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。

发明内容