[发明专利]区分clade 2．3．2．1和clade 2．3．4．4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物

说明书

本发明提供了一组区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物，利用clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）特征性核苷酸序列存在GC含量差异来设计。利用本组引物对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行实时荧光定量PCR反应均可有效扩增，但其在clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线存在熔解温度（Tm值）差异来对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行有效区分。配合和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑并利用仪器自带的分析软件，可达到仅需一组引物，即可特异性的对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染情况进行鉴别诊断。本发明鉴定方法简单，效率和准确率较高。

技术领域

本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一组区分clade 2.3.2.1和clade2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物。

背景技术

禽流感（Avian influneza，AI）是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病。高致病性H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenzavirus, H5 AIV）引起的感染目前被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，在我国被列为一类动物疫病。

关于流感的最早记录可追溯到1878年来自意大利的一次报道，随后世界各地陆续发生流感的暴发和流行。1996年，在我国分离到的第一株H5N1亚型HPAIV（A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），GS/GD/96），紧接着香港于1997年发生H5N1亚型禽流感病毒直接感染人事件，这是第一个禽源流感病毒未经中间宿主而直接感染人的证据。由于从祖源病毒GS/GD/96进化出多个谱系且命名不统一，为此WHO、FAO和OIE联合制定了H5N1 HPAIV统一分类准则将H5N1 HPAIV分为0~9共计10个不同clade。其中clade 2.3.4最早于2003~2006年间流行于中国、越南、泰国、老挝和马来西亚等地的病毒株，2006~2009年clade 2.3.4分支在我国很多地区是优势流行株；而2010年后逐渐被clade 2.3.2.1分支取代，以A/duck/Guangdong/S1322/2006为HA和NA基因供体研制Re-6株疫苗来控制clade 2.3.2.1分支病毒的流行。近年来，出现了clade 2.3.4.4分支病毒，针对该类病毒研制了Re-8株疫苗。对clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5 AIV相应疫苗的科学使用。

然而，clade 2.3.2.1和clade 2.3.4二者之间的基因序列核苷酸同源率大于94.3%（以经典毒株的同源率为例），很难通过常规的分子生物学方法（如常规RT-PCR方法）进行鉴别。本发明的一组区分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的实时荧光定量PCR引物仅需1组引物对（2条引物）即可有效对clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV进行有效区分。该引物根据clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的特征性核苷酸序列差异来设计；利用实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线的Tm值和其GC含量正相关的特点，通过观察clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV经该组引物进行实时荧光定量PCR扩增反应后的熔解曲线Tm值差异，即可精确对clade 2.3.2.1和clade2.3.4.4 H5 AIV感染情况进行准确鉴别诊断，相关研究尚未见国内外文献报道，本发明可填补相关领域空白。

发明内容