[发明专利]一种恒温条件下合成核酸的方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种恒温条件下合成核酸的方法。本发明包括以下步骤：1)提供一种核酸，所述核酸的3’末端具有与同一条链上的F1c区退火的F1r区，并且通过所述F1r区与Flc区的同时退火可形成螺旋环；2)以步骤1)所述核酸为模板合成其自身的互补链；3)通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤2)中所合成的互补链。本发明所述寡核苷酸在引物的5’‑侧所提供的核苷酸序列，基本上与以该引物为合成起点而合成的区域相同。本发明在单纯试剂的组成上实现了基于恒温反应的核酸合成。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种恒温条件下合成核酸的方法，特别涉及由特异性核苷酸序列构成的可形成特殊结构核酸的合成方法，及基于该特异性核酸序列的一种有用的扩增核酸的方法。

背景技术

生物体所携带基因信息的生物体的最根本差异，基于核苷酸序列互补性的分析方法可直接分析基因所携带的遗传特征。该分析是一种鉴定遗传疾病、癌变、微生物等非常强有力的方法。当样品中靶基因含量非常少时一般不易检测，因此必须对靶基因进行扩增或使其检测信号放大。作为扩增靶基因的方法，PCR方法被认为是最经典方法(Saiki，Gelfandet al.1988)，亦是体外核酸序列扩增应用最为普遍的技术。该方法指数式扩增结果使其具有高灵敏度，确立了其在分子生物学方法检测领域的地位，经几十年发展已有系列成熟产品。此外，扩增产物可回收使用，因此作为一种支持遗传工程技术如基因克隆和结构决定的重要工具，亦得到广泛应用。然而，PCR方法明显有下述的问题：实际操作中必须要用专门的程序温度控制系统；扩增反应的指数式上升导致难于定量；样品和反应溶液易受到外部污染，假阳性问题较为突出。

当前人类基因组计划已经完成，单核苷酸多态性(SNPs)显示出数量多、分布广泛的特点，故其分析逐步受到重视。通过设计引物使其核苷酸序列包含SNPs，依靠PCR扩增来检测SNPs是可行的，即通过是否存在与引物互补的核苷酸序列可通过是否存在反应产物的决定得出推断。然而，一旦PCR中偶然误合成互补链，在接下去的反应中该产物以模板运行，就会造成错误的结果。实际应用中，若引物末端仅一个碱基不同则将很难严格控制PCR，故必须改进特异性使PCR更好应用于SNPs的检测上。

另一方面，相较于繁琐的程序温控过程合成核酸，科学家亦开发出在恒温条件下合成核酸的技术(Zhao，Chen et al.2015)，主要包括以下几种：依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶的扩增(HDA)、重组聚合酶扩增(RPA)。

NASBA，也称TMA(转录介导扩增方法)不需要复杂的温度控制。该方法通过DNA聚合酶以靶RNA为模板，加入连接有T7启动子的探针而得以合成，第二探针进入双链使产物得以生成，接着以生成的双链DNA为模板通过T7RNA聚合酶转录而扩增得到大量的RNA产物。NASBA需要热变性步骤直到双链DNA形成，但是接下去的转录反应在等温条件下通过T7RNA聚合酶得以进行。必须要用多种酶组合例如反转录酶，RNase H，DNA聚合酶和T7RNA聚合酶，然而多种酶的组合对于费用是不利的。同时由于复杂的多种酶反应条件设定，该方法很难作为一般的分析方法得以推广。

RCA(滚环扩增，Rolling Circle Amplification)旨在模仿微生物中环状DNA的滚环复制过程，对于环状单链DNA模板，与该模板相结合的引物在原方法仅能实现对于环状核酸的扩增。为使得该方法可通用于线性DNA的扩增，通过挂锁探针(padlock probe)或环形探针互补的单链DNA显示具有一系列核苷酸序列与挂锁探针(padlock probe)或环形探针互补的单链DNA在靶核苷酸存在下可被连续的合成(Lizardi，Huang et al.1998)。该方法亦存在需多种酶的问题。而且，互补链合成的启动取决于连接两邻近区的反应，并且其特异性基本上与LCR中的相同。