[发明专利]一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗。

背景技术

兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发。主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气管黏膜充血、水肿。鼻腔内有浆液性、黏液性或黏液脓性分泌物。在肺门支气管周围到肺的边缘见有支气管肺炎病灶。病变多见于心叶、尖叶，严重的病例，波及全肺叶。病变部隆起、坚硬，呈暗红色，褐色，进而为灰黄色。有些病例肺上有大小不等的脓疮。严重的占肺部的90％以上。有的肝脏表面有黄豆至蚕豆大的脓疮。脓疮破后可见黏稠的奶油状乳白色的脓汁。还见有心包炎、胸膜炎、胸腔积脓及肌肉脓肿等。

兔支气管败血波氏杆菌病主要采用生物安全措施和疫苗预防接种。其中生物安全措施主要包括：加强饲养管理，改善饲养环境，做好防疫工作；兔场最好坚持自繁自养；对新引进的兔，必须隔离观察1个月以上，经细菌学与血清学检查为阴性者方可入群。本病常与巴氏杆菌混合感染，兔群一旦发病，必须查明原因，消除外界刺激因素，隔离感染兔，以控制病原传播。兔支气管败血波氏杆菌病较难治愈，需要加强规模化兔场的免疫，目前主要用分离到的支气管败血波氏杆菌制成灭活菌苗，进行预防接种，每只兔皮下注射1mL，每年2次；也有用兔巴氏杆菌—波氏杆菌二联苗或巴氏杆菌—波氏杆菌—兔病毒性出血症三联苗预防接种(杜雅楠等,2006；黄艳艳等,2006)。但兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗容易出现细菌毒素残留问题，常导致免疫兔发病，因此，目前迫切需要一种能够防控该病的安全性、效力好的疫苗，从而弥补现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，即通过原核表达载体构建出能表达兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白的大肠杆菌BL21重组基因工程菌，从而制备出兔支气管败血波氏杆菌基因工程重组亚单位疫苗，弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种新型的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

编码上述抗原蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明再一个方面提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其中抗原为兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

上述的基因工程亚单位疫苗，优选为氢氧化铝胶苗；

本发明所提供的兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗中，主要保护性抗原蛋白PPP的含量优选不少于160μg/ml；

本发明的兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其制备方法包含如下的步骤：

1)将兔支气管败血波氏杆菌接种于TSB培养基37℃培养过夜，次日，5000r/min离心5min，吸尽上清弃掉，提取细菌总DNA作为模板；

2)通过PCR方法扩增出兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原PPP基因，回收PPP基因目的片段；

3)将PPP基因的目的片段按正确阅读框架插入表达载体pET32a(+)中，构建成表达重组质粒；

4)将构建的表达重组质粒通过转化BL21宿主菌,构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌的基因工程重组大肠杆菌；用该重组基因工程菌表达出兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白；

5)对融合蛋白进行纯化、复性后，加入氢氧化铝胶相制成疫苗。