[发明专利]一种肝素前体硫酸化修饰酶的表达方法在审
| 申请号： | 201710033024.0 | 申请日： | 2017-01-13 |
| 公开（公告）号： | CN106754808A | 公开（公告）日： | 2017-05-31 |
| 发明（设计）人： | 尹鸿萍;杨轶伟;王莹;黄凤杰 | 申请（专利权）人： | 中国药科大学 |
| 主分类号： | C12N9/10 | 分类号： | C12N9/10;C12N15/70 |
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| 地址： | 211198 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 肝素 硫酸 修饰 表达 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种肝素前体硫酸化修饰酶的表达方法，其主要特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)人工合成两端带有NdeI和XhoI酶切位点的6-ost-3序列，经双酶切后插入表达质粒pET-28a的NdeI/XhoI的位点，获得表达质粒pET-28a/6-ost-3。
(2)将表达质粒pET-28a/6-ost-3转化入大肠杆菌BL21感受态中，获得重组工程菌。
(3)将工程菌接种至LB培养基中过夜震荡培养作为种子液，再将种子液以适当的接种量接种至LB发酵培养基中，当菌液吸光度至一定范围时加入IPTG在诱导表达，离心收集菌体。
(4)菌体重悬于pH7.4的磷酸缓冲液，加入溶菌酶破碎细胞，离心收集上清。
(5)溶菌上清经镍柱纯化，获得6-OST-3酶蛋白溶液。
2.根据权利1所要求的方法，其特征是在于步骤(1)中的6-ost-3序列为新的人工合成序列。
3.根据权利1所要求的方法，其特征是在于步骤(3)中的接种量为1％。
4.根据权利1所要求的方法，其特征是在于步骤(3)中的诱导条件为：加入IPTG的终浓度为0.8-1.0mmol/L，诱导温度为20℃，诱导时间为10-12h。
5.根据权利1所要求的方法，其特征是在于步骤(5)中镍柱纯化的清洗缓冲液为含10mM咪唑的磷酸缓冲溶液，洗脱缓冲液为含100mM咪唑的磷酸缓冲溶液。
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