[发明专利]一种减少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种减少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法。

背景技术

稻曲病是水稻上的重要病害，可给水稻生产造成重大损失。该病害由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染造成。分生孢子是稻曲病菌的无性繁殖体，在稻曲病的病害循环和病害流行中发挥重大作用。在实验室内，分生孢子也是稻曲病研究不可缺少的材料。有关孢子的形成发育生理、对不良环境的生存适应性或抵抗性，孢子与寄主的识别互作反应等研究，都需要使用孢子形态的材料；新型防治药物研发方面的有关研究，如药剂对孢子的致毒效应等，也需要孢子；分子生物学领域的有关研究，如致病相关基因的诱变、定位与克隆等；也离不开孢子；可见，分生孢子是稻曲病日常研究的重要的菌体形态。而且在许多工作中，往往要求研究所用的分生孢子纯净无污染。

稻曲病菌可形成两种形态的分生孢子，一种为厚壁分生孢子，另一种为薄壁分生孢子。在实验室工作中，由于培养制备厚壁分生孢子存在较大的技术困难，因而多使用其薄壁分生孢子，后文的“分生孢子”或“孢子”均指稻曲病菌的薄壁分生孢子。

长期以来，文献公开的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法，主要是液体培养方法，该方法的主要技术步骤是，先培养准备稻曲病菌的菌丝体，再将菌丝体移植入液体培养基进行液体振荡培养，直至获得孢子；该培养方法可以获得大量的分生孢子，不过，实践工作中也发现一些不足，如耗时较长，整个过程一般需要15天以上；培养产物混合液中包含有大量的培养基组分、菌体代谢产物和菌丝团等；培养工作需要振荡培养设备；由于该孢子较小且培养产物呈粘稠状态，要沉淀获得较为单纯的孢子液，往往需要高速离心机设备。

随着研究探索的进展，最近已经建立了稻曲病菌薄壁分生孢子的固体培养方法，即用培养皿作培养器具，用琼脂固体培养基培养制备孢子。该方法可弥补上述液体培养方法的一些不足，不过又出现另一弊病，就是缘于培养皿的结构特性，制备培养的孢子成品容易被污染。

一般实验室使用的培养皿由皿底和皿盖组成，限于当前培养皿的制作工艺技术，皿底与皿盖间很难达到均匀贴合的程度，大多数培养皿的皿底与皿盖间存在较大缝隙，培养皿内外的空气流动可畅通无阻。因此，利用普通培养皿制备培养的分生孢子产物容易受外界污染空气的干扰，容易得到带有杂菌污染的孢子成品。尤其是一般的植物病理学实验室，当前均偏好于配置具有降温/升温功能的培养箱，该类培养箱通常为了实现工作室内快速恒温及温度均匀分布状态，往往将工作室设计为循环空气的模式。利用这类培养箱进行的产孢培养，培养皿周围空气处于常流动状态，造成培养皿内材料污染的机率相当高，通常培养5天可造成50％以上的培养平板被杂菌污染，即使一些培养平板上看不到明显的青霉菌等污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染机率仍然较大。因此，利用培养皿制备培养稻曲病菌分生孢子，在技术上很难排除污染的可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种减少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种减少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养方法，制备培养方法的步骤如下：

1.采用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。

2.瓶式产孢培养基的制备

用马铃薯培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯100g、琼脂20g、水1000mL；将培养基分装于步骤1准备的三角瓶，常规高压高温灭菌后成为三角瓶式培养基，备用。

3.母代稻曲病菌的移植

以实验室已有的稻曲病菌分生孢子液作母代菌体，用移液器将该母代孢子液移植入步骤2制备的三角瓶式培养基，并使孢子液在培养基面上分散均匀。

4.产孢培养

将步骤3操作完备后的三角瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养。

5.新一代孢子的收集

通常步骤4培养5天后，培养基面上已形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的分生孢子；用无菌水洗脱菌落上的孢子，并集中到灭菌容器内，即获得无杂菌污染的较高质量的稻曲病菌薄壁分生孢子液。

本发明的特色与优点是：

1)无需振荡培养设备，获得的分生孢子液成品含菌丝体、培养基、及菌体代谢外泌产物等较少。

2)三角瓶配上常规瓶塞后，能阻隔普通微生物的通过，很好地保护三角瓶内不受杂菌污染，因而能有效减少污染，获得高质量的孢子成品。

3)产孢菌落一般不产生茂密的气生菌丝。