[发明专利]一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学技术，具体是一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法。

背景技术

稻瘟病是全球水稻生产的重大病害，该病害的致病菌稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)是植物病理学的模式病原菌，国内外都期望通过对稻瘟病菌开展全面和深入的相关研究，以揭示植物病原菌对寄主植物致病的一般规律，进而寻求和建立更为有效可行的植物病害控防途径。

分生孢子是稻瘟病菌的无性繁殖体，在稻瘟病的病害循环和病害流行中发挥重大作用。在实验室内，分生孢子也是稻瘟病研究不可缺少的材料。有关分生孢子的形成发育生理、对不良环境的生存适应性或抵抗性，孢子与寄主的识别互作反应等研究，都需要使用孢子形态的材料；新型防治药物研发方面的有关研究，如药剂对孢子的致毒效应等，也需要孢子；分子生物学领域的有关研究，如致病相关基因的诱变、定位与克隆等；也离不开孢子；可见，分生孢子是稻瘟病日常研究重要的菌体形态，因此，快速、高效地培养制备高质量的分生孢子材料，非常有利于稻瘟病有关研究工作的顺利实施。

当前稻瘟病菌分生孢子的培养制备方法，主要有两大类技术。

一类是采用植物籽粒作培养基的培养法，即先将植物籽粒(如大麦粒等)浸润并灭菌制成培养基，然后将菌丝体移植入籽粒培养基内培养，当菌丝长满籽粒后，用清水洗刷掉籽粒表面菌丝，并转放到方盘类器具内再进行光照培养；该方法通常能制备大量的分生孢子，不过，培养制备全程时间较长(一般需要18天以上)，成品孢子液难以避免杂菌污染，而且存在较多的培养基杂质。

另一类是采用琼脂作凝固剂的培养皿培养法，即先将有关养分(如米糠煮出汁)与琼脂制成固体培养基并用培养皿倒成平板，然后将稻瘟病菌移植入培养皿内的培养基面上，再转到合适条件下培养；直至菌落形成，然后刮除菌落的气生菌丝，增加特定光照培养，直至形成孢子。该方法能克服前述方法的一些不足，如污染程度低，容易获得杂质少的纯净孢子成品；但培养所用的关键器具是培养皿，该类器具有个先天不足，就是培养皿内外是直通的，培养皿外面的污染空气很容易与皿内空气流通交换，因而很难避免培养皿内培养材料被污染，要获得完全没有杂菌污染的分生孢子材料，技术难度大。这对许多需要高质量、无污染状态的孢子的研究工作非常不利。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法，制备培养方法的步骤如下：

1.采用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。

2.瓶式培养基的制备：用燕麦培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：燕麦167g，琼脂20g，水1000mL；将培养基分装于步骤1准备的三角瓶，常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用。

3.稻瘟病菌的移植：用移植工具将实验室常备的稻瘟病菌菌丝体，移植入步骤2制备的瓶式培养基上。

4.培养产孢：将步骤3操作完备后的瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养；通常培养7天后，瓶式培养基面上已形成菌丝密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。

5.分生孢子的收集：用无菌水洗脱步骤4获得的菌落上的孢子，并集中到灭菌容器内，即获得无杂菌污染的较高质量的稻瘟病菌分生孢子液。

本发明的优点是：

1)三角瓶配上常规瓶塞后，能阻隔普通微生物的通过，很好地保护三角瓶内不受杂菌污染，获得高质量的孢子成品。

2)培养期间无需常规制备技术所需要的额外光照、中途也无需刮除菌丝，操作技术简单。

3)三角瓶内收集孢子比培养皿内收集孢子的操作更为方便。

4)三角瓶的保护可使得产孢菌落能随意放置一段时间而不受污染，并保持产孢状态，便于与需要孢子的工作程序衔接。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

本发明的关键技术是三角瓶与琼脂类培养基的结合与应用。

三角瓶虽然属植物病理学实验室的日常器具，但其常规用途主要是装盛培养基灭菌；也常见用于装盛液体培养基、或植物组织类培养基(如籽粒、秸秆等)进行病原菌培养。

琼脂类培养基的应用，现有的技术规范都是使用培养皿作培养器具，将琼脂培养基加热熔化后，倒入培养皿制成培养基平板，并在该培养平板上培养病原菌。