[发明专利]一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

说明书

本发明涉及一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其包括：S1：构建基础载体；S2：靶序列退火复性；S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切；S4：连接和转化；S5：重组质粒的鉴定和提取；S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切；S7：连接、转化和鉴定。其可获得能够特异性作用于草莓的CRISPR/Cas9载体，该载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点，用于草莓的遗传转化试验。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，尤其涉及一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是自2013年兴起的一种高效简便的基因组编辑技术，目前已在动物、模式植物中得到广泛应用。CRISPR/Cas9载体主要由Cas9和sgRNA两个核心部分构成，其中Cas9蛋白主要负责对DNA双链的切割，sgRNA负责对靶序列的识别并引导Cas9蛋白进入切割位点。能够在植物上应用的CRISPR/Cas9载体中，Cas9基因主要由双CaMV 35S启动子或泛素(Ubiquitin)基因启动子等组成型启动子启动，sgRNA片段则由U6snRNA或U3snRNA的启动子启动。由于物种之间的相对独立性，不同物种的U6、U3或Ubi启动子等在其它物种内的启动强度可能出现不同程度的下降，这在亲缘关系较远的物种间尤为显著，而Cas9和sgRNA的表达水平与CRISPR/Cas9的编辑效果紧密相关，因此，针对不同物种分别采用物种特异性的启动子能够收到更好的效果。

目前，拟南芥的U6-1、U6-26、U6-29启动子，水稻的U6、U3启动子，小麦的U3启动子，玉米的U6、Ubi启动子等已先后被应用于各自的CRISPR/Cas9载体中，同时根据不同物种的密码子偏好性分别对Cas9基因序列进行了优化，以尽可能提高Cas9和sgRNA的表达水平，取得了极好的编辑效果。然而，能够特异性作用于草莓的CRISPR/Cas9载体还未见报道。

发明内容

为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一类能够特异性应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其包括：

S1：构建基础载体

以pUC19载体为骨架，采用森林草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.1所示的pSG01载体；

以pUC19载体为骨架，采用栽培草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.2所示的pSG02载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以双CaMV 35S启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQID NO.3所示的pCCF001载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQ ID NO.4所示的pCCU001载体；

S2：靶序列退火复性：合成互补的Oligo DNA，将合成的Oligo序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；

S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；

S4：连接和转化：配置连接体系，将S2获得的稀释后的DNA双链序列与S3获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；