[发明专利]一种提高米曲霉发酵淀粉合成L-苹果酸的方法

说明书

本发明公开了一种提高米曲霉发酵淀粉合成L‑苹果酸的方法，属于基因工程领域。本发明在基因工程菌A.oryzae PN5的基础上，同时过表达葡萄糖苷酶编码基因agdA和淀粉酶编码基因amyB，所得重组菌A.oryzae GAA经96h摇瓶发酵，可将100g/L的淀粉转化成72g/L L‑苹果酸，6.4g/L琥珀酸和0.18g/L富马酸，苹果酸相对于淀粉的转化率(g/g)为0.72，生产强度为0.75，为进一步代谢改造米曲霉发酵淀粉生产L‑苹果酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种提高米曲霉发酵淀粉合成L-苹果酸的方法，属于基因工程领域。

背景技术

苹果酸作为一种重要的四碳二羧酸主要用作食品、饮料中的酸味剂，金属物的清洗剂，以及农业、化妆品和医药等领域。2004年，美国能源部将苹果酸和富马酸、琥珀酸这三种四碳二羧酸均作为可通过微生物利用可再生原料发酵大规模生产的12种平台化合物之一。

目前发酵法生产苹果酸主要是通过细菌或丝状真菌发酵葡萄糖，或高密度培养Ustilago trichophora发酵甘油等。细菌在糖代谢过程中，会产生乙酸、乳酸等副产物；丝状真菌的糖代谢则伴随着较高的柠檬酸、琥珀酸和富马酸等的产生。甘油发酵产酸需要较高浓度的菌体和较长的发酵周期，不利于工业化生产，而以葡萄糖作为发酵原料，与工业淀粉相比，成本高出1.2～1.5倍。

淀粉质原料来源广，价格低廉，是工业生产中理想的碳源。众所周知，米曲霉作为“generally regarded as safe”(GRAS)菌株，早在1000多年前已被应用于食品、饲料、产酸、酿酒等发酵工业，具有极强的淀粉酶分泌能力。基于现有技术关于发酵淀粉生产苹果酸的研究，米曲霉发酵淀粉生产苹果酸已变得可能，但仍存在很大的提升空间。由于可溶性淀粉溶于热水后成糊状，极低的流动性会影响传质和菌体生长，因此，提高菌体对淀粉的利用能力对于提高苹果酸的发酵水平有重要作用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种基因工程菌，是以米曲霉为宿主，共表达编码淀粉酶的基因amyB和编码葡萄糖苷酶的基因agdA

在本发明的一种实施方式中，所述基因amyB是NCBI Gene ID为5996200的基因，所述基因agdA是NCBI Gene ID为5992274的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pBg32为载体，所述pBg32已于申请号为201610603538.0的发明专利中公开，该质粒以pMD19为出发质粒，通过连接米曲霉磷酸甘油酸激酶启动子(Ppgk)、构巢曲霉的苯菌灵抗性基因(e)和葡萄糖淀粉酶终止子(Tgla)构建而成。

在本发明的一种实施方式中，以淀粉诱导型强启动子PamyB表达基因amyB，以PagdA表达基因agdA；所述PamyB序列如SEQ ID NO.1所示；所述PagdA序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以过表达了葡萄糖淀粉酶基因glaA的工程菌A.oryzae PN5为宿主；所述A.oryzae PN5是以质粒pMD19为载体，以SEQ IDNO.7所示的淀粉诱导型的强启动子介导的，过表达NCBI Gene ID为5999830的glaA基因的重组米曲霉。

本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法是将Gene ID为5996200的基因amyB、Gene ID为5992274的基因agdA与载体连接，转化至宿主细胞中。

本发明的第三个目的是提供一种以淀粉为底物生产L-苹果酸的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，28～30℃，200～250rpm发酵48～96h。