[发明专利]羊驼MC1R转基因表达载体及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种由羊驼MC1R转基因克隆得到的MC1R表达载体，以及所述表达载体的构建和应用。

背景技术

对于哺乳动物而言，黑素皮质素受体-1(MC1R)基因和编码Agouti蛋白的基因是影响真黑素和褐色素分布及数量多少的主要基因。MC1R存在于成熟黑色素细胞表面，黑素皮质素激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)是它的天然配体。α-MSH是一种神经内分泌激素，由13个氨基酸组成，是由POMC生成，能加快黑色素细胞的分裂。角质化细胞也会合成α-MSH，可能是黑素细胞生长的“纯天然”因子。MC1R与α-MSH的亲和力最高，两者合在一起后可激活黑色素细胞接受机体激素调控的主要信号通路，即cAMP信号通路，在动物被毛颜色形成过程中发挥关键作用。而ASP(Agouti信号蛋白)可降低α-MSH与MC1R的结合，影响cAMP信号通路，使cAMP合成减少，进而导致褐色素的生物合成增加，造成动物被毛表型呈黄色。所以，MC1R是控制毛色形成的主要基因，MC1R能够调控α-MSH-MC1R信号转导路经，引起信号转导路径变化，影响哺乳动物毛色的形成。

真黑素和褐黑素都来自共同的酪氨酸酶依赖性途径，拥有相同的前体——酪氨酸。二者由酪氨酸酶催化酪氨酸羟化形成多巴醌的过程是一致的，且该过程中也有衍生物左旋多巴生成。在多巴醌以后，褐黑素和真黑素开始分为两条途径各自合成。多巴醌自身稳定性差，会通过分子内环化作用成为环化多巴，然后很快会被氧化为多巴色素。多巴色素通过脱羧基重排反应生成DHI。多巴色素会在酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)的催化下形成5,6-二羟吲哚-2-羧酸(DHICA)，经下一步氧化反应生成真黑素聚合物，动物毛色因而表现为黑褐色。其中两种酶决定了真黑色素的生成，分别为酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)(糖蛋白75或b位点)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)。TRP1、TRP2同色氨酸组分有40～45%的一致性，因此TRP1、TRP2可作为分化标记。褐黑素的形成过程中有半胱氨酸(CyS)和谷胱苷肽(Glu)参与，多巴醌和半胱氨酸会先形成5-S-半胱氨酸多巴异构体，随后经氧化还原反应形成醌类混合物，最终转化为褐黑素，动物毛色呈现黄红毛色。

小眼畸形相关转录因子(MITF)基因在色素细胞、肥大细胞、破骨细胞等的发育、分化过程中发挥着重要作用，特别在色素细胞中更是意义重大。MITF基因会调控酪氨酸基因家族的表达，如TYR、TYRP1、TYRP2基因的启动子中包含有“M box”这一共同结构。这个结构的核心序列为“CATGTG”。MITF会通过这个“M box”调控TYR、TYRP1、TYRP2基因的表达。这些基因与黑色素细胞中黑素生成密切相关，MITF就是通过这一途径调节黑色素细胞的色素沉积、分化、增殖和存活。MITF不仅是黑色素细胞发育过程中的重要调节因子，而且在维持黑色素干细胞方面也发挥着至关重要的作用。MITF会促进作为生物合成黑素的主要酶——酪氨酸酶的转录，酪氨酸酶在毛色通路上负责催化酪氨酸形成多巴，进而转化为多巴醌的过程，最终启动黑色素的合成过程。因此，MITF是真黑素和和褐色素的形成过程中的重要转录调控因子。

羊驼的22种毛色性状均能稳定遗传，从转基因动物遗传资源角度看，羊驼是最理想的毛色性状基因的供体。针对羊驼MC1R基因与羊驼毛色的研究结果表明，不同毛色羊驼的MC1R基因和蛋白的表达水平存在显著差异，即羊驼MC1R基因的表达水平决定着羊驼的毛色。

绵羊是我国重要的毛用型经济动物，毛纤维是毛纺织工业的重要原料。培育毛色转基因绵羊，可望提高我国羊毛的综合竞争力，带来巨大的生态效益、经济效益和社会效益，对提高我国羊毛及其制品的内在品质和国际竞争力、提高养羊业和毛纺织业的经济效益以及促进农牧区农村经济发展等具有重大意义。但到目前为止，还没有最适宜的羊驼MC1R转基因表达载体供转基因绵羊所用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够供转基因绵羊所用的适宜的羊驼MC1R转基因表达载体。

提供所述羊驼MC1R转基因表达载体的构建方法和应用，是本发明的另一发明目的。