[发明专利]一种包含噬菌体溶菌酶的表达系统及其运用

说明书

本发明涉及一种包含λ噬菌体溶菌酶的表达系统，通过在大肠杆菌内诱导表达λ噬菌体溶菌酶，实现细菌快速、高效裂解的方法和运用。含有该表达系统的菌株经过冻融或低浓度氯仿处理后，能高效裂解大肠杆菌细胞并释放其菌内蛋白，所得蛋白相比常用的细菌裂解方法，如超声破壁和蛋清溶菌酶消化方法，得到的蛋白具有更高的活性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种包含表达λ噬菌体溶菌酶的基因表达系统及其在细菌裂解和蛋白释放中的运用。

背景技术

革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌，是基因工程中常用的微生物。它们的主要结构包括细胞壁、细胞膜和细胞质，其中细胞质内含有大量可溶性蛋白质。通过将需要表达成蛋白的基因放在质粒载体上，转化到细菌中，人们能利用细菌内部的转录、翻译系统生产大量蛋白。然而要释放表达在细菌内部的蛋白，必须先破坏细胞壁，而革兰氏阴性细菌的细胞壁又相当稳固。目前最常用的破壁方法是超声波。超声破碎一般是将破碎仪的超声发射探头直接放入菌液里进行，效率较高，可达60％以上。但由于超声探头设计的限制，常规的超声破碎仪能有效处理体积为1至500毫升菌液，而处理体积太小或太大的菌液，都需要特殊制备的破碎仪。另外超声处理不可避免地会引起菌液高速对流，容易产生气泡，导致蛋白质变性。

另一种常用的破壁方法是用溶菌酶消化细菌的细胞壁。很多生物，如动物细胞、细菌、噬菌体都能产生溶菌酶。将这些酶，如常用的蛋清溶菌酶，加到菌液中，它们能通过消化细菌细胞壁中的肽聚糖，导致细菌破裂。与超声破壁相比，溶菌酶处理的条件比较温和，能有效降低蛋白变性，但缺点是成本较高，而且破壁效率偏低，一般不超过40％。主要原因是当少量细菌发生破壁裂解后，它们所释放出的蛋白和DNA形成粘稠的溶液，将其它未破壁的细菌紧密包裹，阻碍了溶液中的溶菌酶对它们的细胞壁进行进一步消化。

在已有的发明专利中，CN102286519A公开了一种用于控制宿主自裂解的大肠杆菌表达载体，试图简化基因工程中的细菌裂解步骤。该载体含有T4噬菌体溶菌酶基因。将它在细菌的细胞质里表达后，可以提高细菌对金属离子螯合剂EDTA的敏感度，使它们在EDTA溶液里裂解，并释放出菌内蛋白。该方法虽然与直接加蛋清溶菌酶消化的方法相比，效率上有一定的提升，但与超声方法相比，还是有多个缺点：1.比较费时。一般需要2个小时，而超声处理一般只需要几分钟；2.破壁效率并不是很高。从发明人所公布的数据来看，该方法的破壁效率是超声的83％。因此，目前该方法还难以成为生物工程中细菌裂解的主流技术。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前细菌裂解效率偏低而且容易引起蛋白变性的问题。为此，本发明提供一种处理条件温和，而效率与超声破壁相当的细菌裂解方案。所述方案的原理是将λ噬菌体的溶菌酶(LamR，以下简称λ溶菌酶)表达在革兰氏阴性细菌的细胞质中。由于细胞质中的溶菌酶并不直接接触细胞膜外的细胞壁，它不会对细菌的正常生长产生明显的不利影响。但经冻融或低浓度有机溶剂如氯仿处理后，细菌的细胞膜会发生轻微破裂，使细胞质中的部分溶菌酶转移进入细胞膜和细胞壁之间的缝隙里，消化细胞壁，引起细菌的完全裂解。该方案在菌体裂解速度、蛋白释放效率以及所获得的目标蛋白活性等各方面都明显优于常用的超声破碎方法和前述的T4溶菌酶表达方法。

具体地说，本发明提供了一种包含λ溶菌酶的表达载体(本文也称为“表达系统”)，和对表达了该λ溶菌酶的革兰氏阴性细菌的处理方法及其相关用途。更具体地，本发明涉及用于埃氏大肠杆菌中与基因工程蛋白共表达的λ溶菌酶，包含该λ溶菌酶的任何基因表达元件及组合，及其应用于表达基因工程蛋白的埃氏大肠杆菌，并用于下游蛋白纯化工艺的细菌裂解方法及其用途。

在一实施方案中，本发明的一种包含λ溶菌酶(其蛋白序列号为NP_040645.1)的表达载体，其核苷酸序列号为SEQ ID NO：1，包括一个由四环素启动子控制的λ溶菌酶基因和一个组成型启动子控制的四环素抑制蛋白(Tetracycline repressor protein，简称TetR)基因，所述表达载体通过诱导，在革兰氏阴性细菌中表达λ溶菌酶，其中，所述λ溶菌酶基因为λ噬菌体的R基因LamR。