[发明专利]一种钙黄绿素可视化RT‑LAMP试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒及应用。

背景技术

新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)病，是一种以肝脏不规则坏死，出血斑点和心肌，法氏囊出血为主要特征的新疫病。其主要临床症状为病鸭精神不振、采食量降低或废绝，有些鸭有拉白稀粪、发病急、病程短(24h内)，并且与以往鸭呼肠孤病不一样，该病无软脚现象。该病毒在致病性、抗原性和基因序列方面都有别于番鸭呼肠孤病毒(黄瑜，2009；陈宗艳等，2012；袁远华等，2013)。自2005年以来，该病由福建、广东及浙江等地区不断向其它地区蔓延，来势汹汹，给养禽业的发展带来了巨大的经济损失。

目前常用于新型鸭呼肠孤病毒的检测方法包括病原学诊断法、血清学诊断法和RT-PCR诊断法。病原学诊断法是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在实际应用中有一定的局限性；血清学诊断法包括酶联免疫吸附实验(ELISA)和琼脂扩散试验(AGPT)，其中酶联免疫吸附实验需要配置昂贵的PCR仪器，实验操作的时间消耗较长、复杂，不便于在基层和现场检测的推广和使用，而琼脂扩散试验的敏感性不高；而RT-PCR技术需要特殊的仪器设备(如PCR仪和凝胶成像系统等)和专业人员进行相关的操作，显然无法满足基层和现场检测的需求。

近年来，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)广泛应用于各种病原的快速诊断，于可响等(于可响,马秀丽,韩宏宇等.新型鸭呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].生物技术通报.2015，31(8):71-75.)针对NDRV的σB蛋白保守序列设计了4对引物，建立了RT-LAMP可视化快速检测方法，对NDRV RNA最低检出量为0.1pg，敏感性约为常规RT-PCR方法的100倍，但其需要开盖加入SYBR Green I荧光剂，检测方法不够优良，检测结果易出现假阳性现象。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒及其应用，旨在解决现有技术中对新型鸭呼肠孤病毒检测方法操作复杂、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。

本发明的技术方案如下：

一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其中，包括引物组、钙黄绿素、氯化锰；

所述引物组如下：

上游外引物F3：5’-CGTGGATGGTCAAAGTCGT-3’；(SEQ ID No.1)

下游外引物B3：5’-ACCTACACTCCAGGAAGGAC-3’；(SEQ ID No.2)

上游内引物FIP：

5’-TAGTTCTGGCATGGCCTCGC-CTTTACATGTGCTGCAGGGA-3’；(SEQ ID No.3)

下游内引物BIP：

5’-TGTTCGGACGTTCTCTTCCGGA-TTTAATGGCGCGGACGAC-3’；(SEQ ID No.4)

环引物LoopF：5’-AGCCTAGATTCGCACTCCG-3’；(SEQ ID No.5)

环引物LoopB：5’-CGAGGAGACTACCCACGTT-3’；(SEQ ID No.6)。

一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其中，还包括新型鸭呼肠孤病毒RNA模板。

一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其中，RNase-free water、10倍反应缓冲液、dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、Bst聚合酶和AMV反转录酶。

一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其中，还包括2.5mmol/L的dNTPs、5mmol/L的甜菜碱、100mmol/L的MgSO₄、625mmol/L的钙黄绿素、25mmol/L的MnCl₂、8U/μL的Bst聚合酶和10U/μL AMV的反转录酶。

一种钙黄绿素可视化RT-LAMP试剂盒，其中，所述外引物F3+B3的浓度为10μmol/L，所述内引物FIP+BIP的浓度为10μmol/L，所述环引物LoopF+LoopB的浓度为10μmol/L。