[发明专利]检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒、反应体系及方法

权利要求书

1.一种检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，包括：具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测T790M突变的荧光探针和具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测野生型的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针均存在于引物探针混合液中。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM，所述下游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM，所述检测T790M突变的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM，所述检测野生型的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括数字PCR反应预混液，优选QuantStudio^TM3D Digital PCR Master Mix v2。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品，所述阳性质控品通过以下方式制备获得：将EGFR T790M突变细胞系基因组DNA与野生型细胞系基因组DNA混合后使T790M突变基因组DNA的比例占总DNA的约1.0％，再将所得混合DNA打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品，所述阴性质控品通过以下方式制备获得：将不含有EGFR T790M突变的EGFR野生型细胞系基因组DNA打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。

7.一种检测人类EGFR基因T790M突变的PCR反应体系，其特征在于，包括：

其中所述引物探针混合液中包括具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测T790M突变的荧光探针、具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测野生型的荧光探针；上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针在PCR反应体系的终浓度分别为800nM、800nM、200nM和200nM。

8.根据权利要求7所述的PCR反应体系，其特征在于，所述DNA模板的来源为血浆游离DNA或肿瘤组织中提取的基因组DNA。

9.一种检测人类EGFR基因T790M突变的芯片式数字PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)配制权利要求7所述检测人类EGFR基因T790M突变的PCR反应体系；

2)把反应体系上样到数字PCR芯片中；

3)把数字PCR芯片放入专用PCR仪中，进行PCR扩增；

4)从专用PCR仪中取出芯片并放至室温后，将芯片放入芯片扫描仪中扫描荧光信号；

5)计算机根据荧光信号计算突变比例。

10.根据权利要求9所述的芯片式数字PCR方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：(1)96℃，10min；(2)继续进行39个循环，每个循环包括57℃进行2min，然后98℃进行30sec；(4)39个循环之后在57℃保持2min；之后在10℃下保持不超过12小时。